葡萄體胚發(fā)生、遺傳穩(wěn)定性及其多倍體植株再生研究.pdf

1、葡萄是世界極為重要的果樹作物，遺傳背景復(fù)雜、育種周期長，因而使得常規(guī)育種在葡萄品種改良上受到極大限制。但是隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用體胚進(jìn)行無性系變異育種和遺傳轉(zhuǎn)化為葡萄品種的定向改良以及種質(zhì)快繁提供了可能。通過體細(xì)胞、組織、器官等外植體建立穩(wěn)定高頻的葡萄體胚再生體系是利用體胚進(jìn)行葡萄品種改良的先決條件。目前有關(guān)葡萄體胚再生體系的研究報(bào)道較多，但是普遍存在再生效率低、周期長等問題，缺乏對(duì)體胚發(fā)生影響因素以及發(fā)育形態(tài)學(xué)、組織學(xué)等方面系統(tǒng)的認(rèn)

2、識(shí)；有關(guān)葡萄體胚發(fā)生過程中遺傳穩(wěn)定性分析和利用體胚誘導(dǎo)無性系變異育種方面的報(bào)道更是鮮見。為此，建立穩(wěn)定高頻的葡萄體胚再生體系，揭示體細(xì)胞無性系變異規(guī)律，利用體胚誘導(dǎo)多倍體育種對(duì)于葡萄遺傳改良、離體快繁和種質(zhì)保存等方面具有重要的意義。 本文主要從體胚發(fā)生、影響因子、生理生化變化、胚性基因表達(dá)、嵌合體的發(fā)生、無性系變異以及遺傳穩(wěn)定性分析的分子標(biāo)記等方面，對(duì)葡萄體胚發(fā)生和利用研究進(jìn)行了綜述和討論。針對(duì)前人研究中存在的問題，從三個(gè)方面進(jìn)

3、行了研究：以葡萄未成熟合子胚為外植體，在建立高頻體胚再生體系的基礎(chǔ)上，對(duì)葡萄體胚發(fā)育形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了研究; 從染色體、DAN含量和分子水平，對(duì)體胚再生植株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析；通過誘導(dǎo)處理體胚，對(duì)體胚再生多倍體植株從染色體和氣孔特性方面作了鑒定。這些研究將為進(jìn)一步利用體胚進(jìn)行無性系變異育種、遺傳轉(zhuǎn)化、人工種子研制和分子生物學(xué)等方面的研究奠定基礎(chǔ)。本研究取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1 體胚再生體系建立及其

4、體胚發(fā)生的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究 1．1以釀酒葡萄未成熟合子胚為外植體，通過植物生長調(diào)節(jié)劑、光照、溫度等因素的控制，研究了葡萄體胚發(fā)生、保存及植株再生。結(jié)果表明：以NN為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)胚性愈傷組織適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑水平是1.0mg/L2,4-D，誘導(dǎo)率65.8～85.4％；誘導(dǎo)體胚的生長調(diào)節(jié)劑水平是1.0mg/L NAA+0.5mg/L BA，誘導(dǎo)率10.5～37.5％；體胚成熟及植株再生的生長調(diào)節(jié)劑水平是0.0

5、5mg/L NAA+0.5 mg/L BA，成苗率為15.5～42.1％。溫度5℃微光(500Lx)條件有利于體胚的保存。 1．2體胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察表明：葡萄未成熟合子胚誘導(dǎo)可形成胚性和非胚性兩類不同的愈傷組織，前者胞壁規(guī)則、核大、胞質(zhì)濃縮、質(zhì)膜緊貼細(xì)胞壁，胚體內(nèi)細(xì)胞間存在胞間連絲，富含淀粉粒；體胚經(jīng)胚性愈傷組織產(chǎn)生，起源于愈傷組織表層單細(xì)胞。 1．3體胚發(fā)生形態(tài)學(xué)和組織學(xué)研究表明：葡萄體胚的形成經(jīng)歷了多細(xì)胞原胚、球

6、形胚、梨形胚、心形胚和子葉胚5個(gè)典型的發(fā)育階段，并發(fā)育成正常植株。與此同時(shí)，有些體胚發(fā)育過程中出現(xiàn)連體胚、芽端畸形胚、超度含水狀胚等畸形胚。 1．4體胚轉(zhuǎn)化和再生植株研究表明：體胚成熟的標(biāo)志是葉綠素和子葉的形成；過大過小的體胚都不能很好地再生成苗；即使轉(zhuǎn)接發(fā)育進(jìn)程基本一致的體胚，在隨后的培養(yǎng)過程中體胚發(fā)育進(jìn)度也不同步，甚至產(chǎn)生次生體胚。這表明本研究建立的體胚再生體系條件還需進(jìn)一步優(yōu)化，以提高體胚再生率和避免畸形體胚的發(fā)生。

7、 2 體胚再生體系遺傳穩(wěn)定性分析 2．1選擇來自于同一未成熟合子胚誘導(dǎo)的體胚再生的植株，染色體鑒定結(jié)果表明，體胚再生植株根尖細(xì)胞染色體數(shù)與供體母株一致，未檢測(cè)到其它倍性細(xì)胞。 2．2采用細(xì)胞流式儀自動(dòng)測(cè)定的DAN含量分布情況分析表明，通過體胚形成的再生植株DNA含量與供體母株一致，正常二倍體細(xì)胞分別占細(xì)胞總數(shù)的78.8％和83.5％：四倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞DNA含量的比值分別為1.960和1.963，約等與2。雖然二者

8、均存在DNA含量加倍的細(xì)胞，分別占檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的12.9％和16.5％，這里染色體加倍細(xì)胞的存在不能歸咎于遺傳變異，而與細(xì)胞分裂周期有關(guān)。 2．3通過優(yōu)化反應(yīng)條件和篩選隨機(jī)引物，應(yīng)用38條引物，對(duì)14個(gè)再生植株進(jìn)行RAPD檢測(cè)。結(jié)果有8條引物呈現(xiàn)良好的多態(tài)性和穩(wěn)定性，每條引物擴(kuò)增出的片段數(shù)在3～7條之間，平為5.8條，所得的片段大小介于150～1200bp之間，8條引物產(chǎn)生的46條可讀帶，與供體母株帶型一致。三方面的結(jié)果充分說明

9、通過該體系再生植株遺傳特性穩(wěn)定，無體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生。當(dāng)然，本研究僅從染色體數(shù)、核DNA含量和分子水平來判斷遺傳穩(wěn)定性是不夠的，還需從表型、生理、生化等方面進(jìn)一步研究。 3. 利用二倍體體胚誘導(dǎo)多倍體植株研究 多倍體葡萄因其高產(chǎn)、抗病、粒大、核少的優(yōu)點(diǎn)受到育種家的重視。其育種手段長期以來主要采用在組織或器官水平上誘導(dǎo)染色體加倍，但存在問題是嵌合體多，效率低。本研究在建立體胚再生體系的基礎(chǔ)上，以幼小體胚為外植體，研究了

10、秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)體胚生長發(fā)育和誘導(dǎo)染色體變異的影響。結(jié)果表明，隨濃度和處理時(shí)間的增加，體胚發(fā)育遲緩，體胚存活率和植株再生率顯著下降，但誘導(dǎo)染色體加倍效應(yīng)增加。隨機(jī)選取誘導(dǎo)處理獲得的29株再生植株，利用染色體計(jì)數(shù)和細(xì)胞流式儀進(jìn)行倍性分析表明，5 株為同質(zhì)四倍體，染色體數(shù)為76，DNA含量也較其對(duì)照加倍。誘導(dǎo)體胚染色體加倍最佳的處理濃度是20mg/L，處理1～3d，均可誘導(dǎo)四倍體，誘導(dǎo)率2.7％。以濃度10mg/L處理3d的誘導(dǎo)率為

11、0.7％。對(duì)獲得的四倍體植株從葉片氣孔特性方面研究表明，四倍體植株較二倍體孔徑增大，密度降低。植株倍性水平和氣孔參數(shù)的相關(guān)性分析表明，氣孔特性可作為誘變植株倍性水平的早期鑒定。 綜上所述，本研究在建立高頻穩(wěn)定的葡萄體胚發(fā)生和植株再生體系的基礎(chǔ)上，證實(shí)了體胚發(fā)生過程中形成的胚性和非胚性愈傷組織在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上有顯著的區(qū)別，體胚起源于愈傷組織表皮單細(xì)胞，其發(fā)育階段具有合子胚形成特點(diǎn)；從染色體、DNA含量和RAPD分子標(biāo)記方面證實(shí)體胚