L-精氨酸對樹突狀細(xì)胞表型及功能的影響.pdf

1、背景和目的：膿毒癥(sepsis)是指由感染所導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染后出現(xiàn)的常見并發(fā)癥;進(jìn)一步發(fā)展可出現(xiàn)感染性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS),是臨床危重病患者主要死亡原因之一。近年來研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫功能紊亂密切相關(guān),恢復(fù)機體免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)和內(nèi)環(huán)境平衡,在膿毒癥的治療和改善其預(yù)后等方面具有重要意義。而樹突狀細(xì)胞(DC)是功能最強的抗原呈遞細(xì)胞(APC),被認(rèn)為是免疫反應(yīng)的啟

2、動者,是免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)器;可激活天然免疫系統(tǒng),啟動更持久的適應(yīng)性免疫,誘導(dǎo)胸腺清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞,分化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,維持自身免疫耐受。在膿毒癥發(fā)病過程中,樹突狀細(xì)胞發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用,通過改變DC數(shù)量及功能來改變膿毒癥患者的預(yù)后將逐漸成為可能。本研究以外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞為研究對象,從細(xì)胞免疫表型和抗原提呈能力等方面觀察L-精氨酸對樹突狀細(xì)胞功能的影響,以明確L-精氨酸對樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機制,以期為L-精氨

3、酸(L-arg)作為免疫調(diào)節(jié)藥物在膿毒癥治療過程中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞(PBMC),在12小時貼壁后加入粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4),到第6天將培養(yǎng)的PBMC隨機分為A、B、C、D、E、F六組;A組為對照組,僅加入上述細(xì)胞因子,B、C、D、E、F組分別加入腫瘤壞死因子α(TNF-α)10ng/ml,L-arg20μmol/ml,TNF-α10ng/m

4、l+L-arg20μmol/ml、TNF-α10ng/ml+L-arg50μmol/ml、TNF-α10ng/ml+L-arg100μmol/ml,用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞形態(tài)。六組分別取培養(yǎng)第1天、第8天的DC,在PBS洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml,取100μl懸液加入流式試管中,然后加入FITC標(biāo)記的CD1a、CD80、HLA-DR, PE標(biāo)記的CD83的抗體各20μl,避光靜置30min,PBS再次洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測其

5、細(xì)胞表型。另取健康成人外周血20ml按上述方法分離PBMC,取非貼壁細(xì)胞分別與培養(yǎng)至第8天的上述六組DC共同培養(yǎng)4天后,每孔加入MTT液10μl,繼續(xù)培養(yǎng)1h后加入二甲基亞砜(DMSO)100μl,在酶標(biāo)儀490nm處測出光密度(OD)值。使用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組間比較采用 t檢驗。
　　結(jié)果:除對照組外,其余各組在倒置顯微鏡下均表現(xiàn)出DC典型的形態(tài)學(xué)特征。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示B(TNF-α)、C(L-a

6、rg20μmol/ml)、D(TNF-α+L-arg20μmol/ml)、E(TNF-α+L-arg50μmol/ml)、F(TNF-α+L-arg100μmol/ml)組CD80、CD83、CD1α、HLA-DR表達(dá)均高于對照組(均P<0.05);CD80、CD83、CD1α、HLA-DR的表達(dá),B組與C組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),D組與C組表型表達(dá)無明顯差異(均P>0.05),E組、F組明顯高于B組(均P<0.05);

7、E組和F組也同樣明顯高于D組(均P<0.05),E、F組之間無明顯差異(均 P>0.05)。同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示 B、C、D、E、F各組OD值分別為0.36±0.04、0.32±0.04、0.43±0.05、0.88±0.06、0.86±0.07,顯著高于對照組的0.09±0.03(均P<0.01),而D、E、F組OD值明顯高于B組(均P<0.05)。其中E、F組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而E、F組OD值高于D組