姬松茸多糖、亞硒酸鈉對樹突狀細胞表型及功能成熟的影響.pdf

1、背景和目的：姬松茸(Agaricus blazei Murill),原產(chǎn)于巴西,是一種食藥兼用的珍稀食用菌。1960年被研究員Takatoshi Furumoto發(fā)現(xiàn)并帶到日本進行研究。子實體和純系培養(yǎng)的菌絲體可以分離得到多種活性代謝產(chǎn)物如活性多糖、活性核酸、活性甾醇類及外源凝集素等。姬松茸多糖(Agaricus blazei polysaccharides,ABP)作為其主要有效成分,具有明顯的抗癌活性、免疫調(diào)節(jié)和抗突變作用。硒(Se

2、)是人體必需的微量元素,于1817年被瑞典學(xué)者Berzelius發(fā)現(xiàn),具有廣泛的生物學(xué)功能,特別是對多種腫瘤的生長具有抑制作用。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前已知的機體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞(APC),與其它APC相比,其最大的特點是能顯著刺激初始型T細胞增殖,而其它APC僅能刺激己活化的或記憶性T細胞。因此DC是機體細胞免疫反應(yīng)的始動者,在介導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)、抵御惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。機體的抗腫瘤免疫主要是

3、T細胞介導(dǎo)的細胞免疫,而DC對T淋巴細胞的增殖分化有著重要的影響。DC作為一種高效的抗原提呈細胞可通過吞噬、胞飲和受體介導(dǎo)的方式攝取抗原,加工形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物提呈給特異性T細胞,激活相應(yīng)的CD4~+輔助性T細胞(helper T lymphocyte,Th)和CD8~+細胞毒性T細胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL)。CD4~+Th細胞在機體抗腫瘤過程中起重要作用,而且使宿主保留免疫記憶,對防止腫瘤復(fù)發(fā)具

4、有重要意義。DC也可以直接激活CD8~+CTL細胞,誘導(dǎo)CTL特異性殺傷作用。姬松茸多糖發(fā)揮抗癌作用的主要機制是對宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響,從而通過活化巨噬細胞、天然殺傷細胞、T淋巴細胞,誘發(fā)促進干擾素的產(chǎn)生等對腫瘤細胞直接或間接地發(fā)揮作用。硒的抗腫瘤作用機制包括降低致癌因子的誘變性、調(diào)節(jié)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的抗癌活性、促進腫瘤細胞凋亡、對DNA損傷的預(yù)防和修復(fù)、調(diào)節(jié)機體的免疫功能等,然而姬松茸多糖、硒對樹突狀細胞的免疫調(diào)變

5、效應(yīng)鮮見報道。本實驗通過體外試驗研究姬松茸多糖、亞硒酸鈉對樹突狀細胞表型和功能成熟的影響,進一步闡明姬松茸多糖、亞硒酸鈉與DC相關(guān)的抗腫瘤機制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　實驗方法：1.小鼠骨髓來源DO的體外培養(yǎng):拉頸處死小鼠,沖洗出股骨和脛骨骨髓細胞,將紅細胞裂解后用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(10ng/ml rmGM-CSF,5ng/ml rmlL-4)培養(yǎng)。隔天半量換液。
　　2.培養(yǎng)第3d,實驗組在培

6、養(yǎng)液中分別加入不同濃度(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)的ABP溶液,亞硒酸鈉溶液(0.02μg/ml),設(shè)生理鹽水對照組。
　　3.第6d倒置顯微鏡觀察DC形態(tài)變化,第8d通過流式細胞儀分析各組細胞表面分子CD86和CD11a的表達來評價ABP和亞硒酸鈉對DC表型成熟的影響。
　　4.第8d收集DC,流式細胞術(shù)檢測DC的細胞周期來評價ABP和亞硒酸鈉對DC增殖的影響。
　　5.第8d收集各組經(jīng)AB

7、P和亞硒酸鈉作用的DC作為刺激細胞,經(jīng)絲裂霉素處理后,分別與小鼠脾臟來源的同種異體T淋巴細胞以1:50的比例混合培養(yǎng)96h后收獲T細胞,流式細胞術(shù)檢測T細胞DNA含量和細胞周期來判斷T細胞增殖情況,評價ABP和亞硒酸鈉對DC致敏的T細胞增殖的影響。
　　6.各組DC培養(yǎng)至第3d,負載H22腫瘤抗原肽,實驗組在培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的ABP溶液,亞硒酸鈉溶液,第8d收集DC,分別與小鼠脾臟來源的T淋巴細胞混合培養(yǎng)48h后收集T淋巴

8、細胞,與小鼠肝癌腹水瘤細胞(H22)混合培養(yǎng)28h,MTT法檢測DC誘導(dǎo)的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對H22肝癌細胞的殺傷活性。
　　7.用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果用x±s表示,多個樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),顯著性水準(zhǔn)為P<0.05。
　　實驗結(jié)果：1.DC培養(yǎng)至第6d,倒置顯微鏡下觀察,對照組可見大部分細胞有樹突樣突起,呈現(xiàn)出典型的非成熟樹突狀細胞的形態(tài)特征

9、;加入ABP(50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)或ABP(100μg/ml)+亞硒酸鈉(0.02μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)至第6d,發(fā)現(xiàn)大部分樹突狀細胞突起減少,細胞變大變圓,呈現(xiàn)出典型成熟樹突狀細胞的形態(tài);亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組細胞生長緩慢,突起不明顯,細胞密度也相對較小。
　　2.體外加入不同濃度的ABP(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)后,DC表達高水平共刺激分子CD86、CD11a

10、(加藥組與NS組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05);亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組DC表面標(biāo)志CD86、CD11a的表達下調(diào);ABP(100μg/ml)+亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組DC表面標(biāo)志CD86、CD11a的表達顯著升高(與其它組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05)。
　　3.ABP(100μg/ml)組DC增殖指數(shù)升高(與NS組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05);亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組DC增殖

11、指數(shù)無明顯變化(P>0.05),ABP(100μg/ml)+亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組DC增殖指數(shù)降低。
　　4.ABP(50μg/ml,100μg/ml)組T淋巴細胞增殖指數(shù)增高(與NS組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組T淋巴細胞增殖指數(shù)降低(P<0.05);ABP(100μg/ml)+亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組T淋巴細胞增殖指數(shù)明顯升高(與其它各組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,

12、P<0.05)。
　　5.MTT法檢測DC誘導(dǎo)的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對H22肝癌細胞的殺傷活性,ABP(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)組殺傷率均升高(與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05);亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組殺傷率亦升高(P<0.05);ABP(100μg/ml)+亞硒酸鈉(0.02μg/ml)組殺傷率無明顯變化(P>0.05)。
　　實驗結(jié)論：1.ABP促進體外培養(yǎng)的DC

13、分化成熟,提高表面共刺激分子CD86,CD11a的表達;亞硒酸鈉抑制樹突狀細胞表面共刺激分子CD86,CD11a的表達;但亞硒酸鈉增強ABP對DC的促分化成熟作用。
　　2.ABP促進體外培養(yǎng)的DC的增殖;亞硒酸鈉減弱ABP對DC的促增殖作用。
　　3.ABP促進DC致敏的T淋巴細胞增殖:亞硒酸鈉增強ABP對DC致敏的T細胞的促增殖作用。
　　4.ABP、亞硒酸鈉均提高T細胞轉(zhuǎn)化的CTL特異性腫瘤殺傷能力,兩者共同存在