豬腸道菌群對乳酸的利用和D型乳酸利用菌的分離、鑒定及代謝研究.pdf

1、高等哺乳動物后腸道中棲息著種類眾多的微生物，數(shù)量高達1013-1014 CFU/mL，這些微生物的代謝活動對維持腸道健康起著重要作用。一些腸道微生物，如乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌等代謝會產(chǎn)生大量乳酸，主要為兩種構(gòu)型:L型乳酸和D型乳酸，其中D型乳酸的積累會對動物產(chǎn)生嚴重后果。實際上，在健康動物的糞樣中乳酸的濃度很低，這是因為乳酸可以被消化道內(nèi)的其他菌群代謝所利用。這些細菌不僅可以代謝消化道內(nèi)過量的乳酸，防止乳酸酸中毒，維持正常pH，而且

2、可以產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs），其對維持大腸的健康有重要作用。目前，關于單胃動物腸道中乳酸利用菌的報道尚不多，特別是在豬源D型乳酸利用菌方面還未見系統(tǒng)研究，因此，本論文首先對豬糞樣中混合菌群利用不同構(gòu)型乳酸的特性進行了初步探討，進一步分離和鑒定糞樣中的D型乳酸利用菌，并研究其體外發(fā)酵特性。論文研究分為三部分:
　　一、仔豬糞樣菌群對不同構(gòu)型乳酸的體外利用特性
　　本試驗旨

3、在比較豬糞樣中菌群對不同構(gòu)型乳酸的利用特性，分別以D型乳酸、L型乳酸或DL型混合乳酸為底物，仔豬新鮮糞樣為接種物進行體外發(fā)酵試驗。測定發(fā)酵過程中乳酸的濃度，并用高通量測序技術分析發(fā)酵前、后發(fā)酵液中菌群變化。結(jié)果表明，發(fā)酵24 h后，添加不同構(gòu)型乳酸時，在門水平上，發(fā)酵樣品中菌群組成無顯著差異，在屬水平上菌群組成有顯著變化，D型乳酸組Coprococcus、Subdoligranulum屬占總菌比例顯著低于L型和DL型混合乳酸組，而Rum

4、inococcus、unclassifiedClostridiales和unclassified Lachnospiraceae占總菌比例顯著高于其他兩種底物組(P＜0.05)。24 h后，發(fā)酵液中Coprococcus、Desulfovibrio和Oscillibacter屬被10倍以上富集，而Blautia、Clostridium、Dorea和Faecalibacterium屬占總菌比例僅為發(fā)酵前的0.1-0.5。結(jié)果表明，豬糞樣微

5、生物對不同構(gòu)型乳酸的利用存在差異，乳酸在后腸道中的積累和菌群之間的互作有關，調(diào)節(jié)微生物菌群組成可能是防止乳酸積累的一個有效途徑。
　　二、豬源D型乳酸利用菌的分離與鑒定
　　本試驗旨在分離豬源D型乳酸高效利用菌，并通過生理生化實驗和分子手段對其進行鑒定。將新鮮豬糞接種到只補充D型乳酸的YCFA培養(yǎng)基，在厭氧條件下培養(yǎng)，共分離純化得到25株腸道菌。通過測定25株菌24 h內(nèi)對D型乳酸的利用情況，篩選到6株高效利用D型乳酸的菌株

6、:J1、J2、J3、J4、J5、J6，它們在24 h內(nèi)對25 mmol/L的D型乳酸利用率均接近100％。通過對D型乳酸利用菌的生理生化和16S rRNA基因序列進行鑒定，6株菌分別被鑒定為:Bacteroidesfragilis（脆弱擬桿菌），為擬桿菌屬的代表株，革蘭氏陰性桿菌;Bacteroides acidifaciens（產(chǎn)酸擬桿菌），此菌株與脆弱擬桿菌的特性相似;Veillonella denticariosi，系統(tǒng)發(fā)育與嚙齒

7、韋榮氏球菌相似;Veillonella caviae（豚鼠韋榮氏球菌），革蘭氏染色陰性厭氧球菌;Bacteriodies uniformis（單形擬桿菌），革蘭氏染色為陰性，無芽孢，專性厭氧型;Megasphaera elsdenii（埃氏巨型球菌）。6株菌均能利用葡萄糖、麥芽糖、乳酸等碳源并產(chǎn)生大量的氣體。
　　三、D型乳酸利用菌的體外發(fā)酵性質(zhì)以及對不同構(gòu)型乳酸利用的研究
　　本試驗旨在研究6株D型乳酸利用菌對D型乳酸的體

8、外發(fā)酵特性以及Megasphaera elsdenii J6對不同底物的發(fā)酵特性。將6株菌分別接種到補充25 mmol/LD型乳酸的YCFA培養(yǎng)基上生長，測定其24 h生長速率，對底物的利用情況以及發(fā)酵產(chǎn)物，6株菌均能在僅添加D型乳酸的培養(yǎng)基上生長良好，并且都可以在24 h內(nèi)完全利用掉25 mmol/L的D型乳酸，產(chǎn)生大量SCFAs。其中，Megasphaera elsdenii J6對D型乳酸的利用速率最快，并且24 h的發(fā)酵產(chǎn)物中丁

9、酸的產(chǎn)量遠高于其它5株菌。將M.elsdenii J6接種到分別添加相同濃度(25 mmol/L)的D型乳酸、L型乳酸、DL型混合乳酸（D型乳酸:L型乳酸分別為1∶1和1∶2）以及葡萄糖的培養(yǎng)基上生長，結(jié)果表明:相對于L型乳酸，M.elsdenii J6更偏愛利用D型乳酸。當M.elsdenii J6生長在D型乳酸為唯一底物的培養(yǎng)基上時，代謝產(chǎn)物中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等短鏈脂肪酸的濃度顯著高于生長在其他構(gòu)型乳酸的培養(yǎng)基上(P＜0.05

10、)。測定M.elsdeniiJ6的D型乳酸脫氫酶的活性顯著高于L型乳酸脫氫酶的活性(P＜0.05)。當M.elsdeniiJ6生長在僅添加葡萄糖為底物的培養(yǎng)基上時，M.elsdenii J6首先將葡萄糖代謝為乳酸，當葡萄糖消耗殆盡之后M.elsdenii J6利用已經(jīng)產(chǎn)生的乳酸進行二次發(fā)酵，說明菌株M.elsdenii J6自身存在一個初級和次級代謝的關系。該結(jié)果說明，優(yōu)先利用D型乳酸的腸道細菌，如M.elsdenii，對腸道內(nèi)D型乳酸