腸道菌群細(xì)菌的鑒定

1、腸道菌群細(xì)菌的鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握革蘭染色法。2.掌握IMViC試驗(yàn)。二、儀器與試劑玻片，接種環(huán)，生理鹽水，酒精燈，結(jié)晶紫溶液，盧戈氏染液，石炭酸復(fù)紅溶液，沙黃液，光學(xué)顯微鏡，二甲基氨基苯甲醛試劑，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，甲基紅試劑（甲基紅0.02g，95%酒精60mL，蒸餾水40mL），6%α萘酚酒精溶液，40%KOH，銨鹽作為唯一氮源，并利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源的培養(yǎng)基，層析濾紙，正丁醇，甲酸，1.5%乳酸，1.5%乙酸溶液，3%

2、溴甲酚藍(lán)酒精溶液，層析缸，需氧血瓊脂平板，厭氧血瓊脂平板，七葉苷培養(yǎng)基，膽汁七葉苷培養(yǎng)基，65gLNaCl血清肉湯，PYR試劑，DNA瓊脂平板，1molL鹽酸，MRS培養(yǎng)基，XGal。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.革蘭染色法（1）涂片：取玻片在火焰上稍微加溫，以清潔紗布擦凈，放置桌上，左手握培養(yǎng)皿，右手持接種環(huán)，用無菌接種環(huán)取生理鹽水一滴，置于載玻片的中央，再用接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷卻后，取培養(yǎng)細(xì)菌少許與鹽水混勻，直接取1~2環(huán)菌液作涂片即可，涂片

3、應(yīng)厚薄均勻。接種環(huán)采菌后，要通過火焰滅菌才能放下。（2）干燥：目的是是菌體水分慢慢蒸發(fā)，固定菌形。涂片最好在室溫中自然干燥，必要是將標(biāo)本面向上，小心斷續(xù)在弱火高處略烘，以助水分蒸發(fā)；但切勿緊靠火焰，以致標(biāo)本烤枯，不堪檢視。（3）固定：手執(zhí)玻片一端，標(biāo)本面向上，在火焰外層快速地來回通過三次，共23秒，以玻片反面觸及皮膚不覺過燙為度。冷卻后，染色。目的是殺死細(xì)菌，是菌體與玻片粘附較牢以及改變對(duì)染料的通透性，因活的細(xì)菌一般不能使許多染料進(jìn)入細(xì)

4、胞。（4）初染：將涂片標(biāo)本夾持于左手，滴加結(jié)晶紫溶液蓋滿涂抹面，染色1~3分鐘，用流水緩緩沖洗（即將龍頭打開使水緩慢流出，將玻片傾斜使水在玻片面上端沿玻片流下沖洗染液）直至無顏色流下為止。（5）媒染：加盧戈氏染液4~5滴作用30秒到一分鐘，再按上法沖洗，并將片上積水輕輕灑凈。（6）脫色：在95%酒精缸中脫色約3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反復(fù)2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色為止，現(xiàn)按上法以流水沖洗，并將玻片輕輕灑凈。（7）復(fù)染

5、：用稀釋石炭酸復(fù)紅（或沙黃液）復(fù)染半分鐘后按上法沖洗。（8）光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌染色情況和1塊厭氧血瓊脂平板(每個(gè)瓊脂平板可劃4~6區(qū)，每區(qū)種一個(gè)可疑菌落)，然后將平板分別放置在需氧、二氧化碳和厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為在厭氧環(huán)境生長，而在需氧和二氧化碳環(huán)境中不生長。5.腸球菌（1）革蘭染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為被染成紫色，即G菌。（2）觸酶試驗(yàn)取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3%H2O21滴，立即觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為無氣泡，即陰性。（

6、3）七葉苷水解試驗(yàn)將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為培養(yǎng)基變?yōu)楹谏搓栃?。?）65gLNaCl生長試驗(yàn)：將待檢菌接種65gLNaCl血清肉湯中，35℃孵育1824h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為細(xì)菌生長且使得培養(yǎng)基變黃，即陽性。（5）PYR試驗(yàn)：挑取被檢菌落在含有PYR的紙片上涂擦，35℃孵育5min，再于紙片上滴加PYR試劑，約1min后觀察紙片顏色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為紙片呈紅色，即陽性。6.梭桿菌屬（1）靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果應(yīng)為棕色的試劑由紫紅變?yōu)榧t色者，即陽性。（2）DNA酶試驗(yàn)法：DNA瓊脂平板上點(diǎn)種待檢菌，35℃孵育18~24h，用1molL鹽酸傾注平板，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為菌落周圍有透明區(qū)，即陽性。（3）觸酶試驗(yàn)取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3%H2O21滴，立即觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為有氣泡，即陽性。7.雙歧桿菌（1）革蘭染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為被染成紫色，即G菌。（2）在基礎(chǔ)改良MRS培養(yǎng)基中添加XGal，對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行檢測(cè)雙歧桿菌單獨(dú)表面