Bacillomycin D的高效合成調控及赭曲霉污染控制研究.pdf

1、Bacillomycin D是枯草芽孢桿菌分泌的一種抗菌脂肽。Bacillomycin D含有多種同系物，雖然結構很早就已經(jīng)被鑒定出來，但至今還沒有純品銷售。在自然條件下，枯草芽孢桿菌中bacillomycin D的含量較低。營養(yǎng)代謝在微生物細胞生長、代謝產(chǎn)物的合成和調控等方面發(fā)揮重要作用。通過營養(yǎng)代謝顯著改善枯草芽孢桿菌合成抗菌脂肽日漸成為國內(nèi)外學者的研究焦點。赭曲霉是一種絲狀真菌，它所產(chǎn)的赭曲霉毒素A(OTA)具有腎毒性、致畸性和致

2、癌性。赭曲霉在食品中廣泛存在，可污染食品，對人類的健康構成嚴重威脅。Bacillomycin D具有很強的抗真菌活性，在食品防腐方面具有很好的發(fā)展前景。
　　本論文主要研究bacillomycin D的純品制備和檢測方法，探索高效合成bacillomycin D營養(yǎng)代謝機制及補料分批發(fā)酵策略，探討bacillomycin D對赭曲霉的抗真菌模式及機理，研究bacillomycin D對OTA的合成的影響，在人工模擬貯藏條件下評估b

3、acillomycin D控制糧食中赭曲霉污染的應用效果。旨在提高bacillomycin D產(chǎn)量，為將來擴大bacillomycin D的工業(yè)化生產(chǎn)和開發(fā)新型防腐劑奠定基礎和提供技術參考。主要研究結果分述如下:
　　1.Bacillomycin D純品制備及檢測方法的建立
　　利用基因檢測法分析B.subtilis fmbJ中是否含有bacillomycin D合成酶基因簇，將擴增出的一段880bp序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)該

4、序列與bacillomycinD合成酶C基因簇的同源性達到99％，B.subtilis fmbJ含有bacillomycin D合成酶C基因簇，具有合成bacillomycin D的潛力。通過鹽酸沉淀、甲醇萃取、柱層析和RP-HPLC分離純化獲得bacillomycin D。HPLC-MS-MS分析可知，bacillomycin D的純度達到95％。Bacillomycin D中有11個活性峰，均含有7肽結構:-Asn-Tyr-Asn-

5、Pro-Glu-Ser-Thr-，分別為bacillomycin D的C14、C15、C16、C17同系物。以bacillomycin D純品為標準品，建立了bacillomycin D的檢測方法。
　　2.菊糖高效合成bacillomyicn D的調控機制
　　研究了不同糖組分對bacillomycin D合成的影響，菊糖能顯著提高B.subtilisfmbJ合成bacillomycin D的能力。采取補料分批發(fā)酵菊糖進一

6、步提高了bacillomycin D的產(chǎn)量。Bacillomycin D產(chǎn)量隨生物量的提高而增加。當在60h進行菊糖補料時，bacillomycin D的產(chǎn)量和產(chǎn)率最大達到1227.49mg/L和10.23mg/L.h，與分批發(fā)酵相比，分別提高了3.12和3.55倍。利用RT-PCR分析了菊糖對bacilomycin D合成相關酶基因和信號蛋白表達的影響，闡明了菊糖促進B.subtilisfmbJ高效合成bacillomycin D的分

7、子機制。菊糖能顯著促進bacilomycin D合成酶基因BYA、BYB、BYC和TE的表達，bacilomycin D合成酶基因表達水平的提高促進了bacilomycin D的合成。菊糖能顯著上調ComA，DegU，δH和Spo0A的表達，ComA，DegU，δH和Spo0A表達量的提高利于形成更多芽孢和增強bacillomycin D合成酶的轉錄活性，因而促進了bacillomycinD的合成。
　　3.L-gln高效合成ba

8、cillomyicn D的調控機制
　　探討了20種常見氨基酸對bacillomycin D合成的影響。結果表明L-arg、L-met、L-thr、L-trp、L-pro、L-asn和L-gln能促進B.subtilisfmbJ合成bacillomycin D，其中，L-gln能顯著增強B.subtilisfmbJ合成bacillomycin D，得到的bacillomycin D產(chǎn)量最高，達到了165.25 mg/L。L-ser

9、、L-tyr、L-ala、L-phe、L-ile、L-lys、L-leu和L-val不利于bacillomycin D的合成，而L-asp和L-cys則能完全抑制bacillomycin D的合成。采取補料L-gln分批發(fā)酵進一步提高了bacillomycin D的產(chǎn)量，當在66h進行補料時，bacillomycin D的產(chǎn)量和產(chǎn)率達到987.52 mg/L和8.26 mg/L.h。研究了L-gln對bacilomycin D合成酶基因

10、表達的影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，L-gln能顯著上調BYA、BYB、BYC和TE的表達，這些基因表達水平的提高促進了bacillomycin D的合成。當以L-gln為氮源時，DegU、δH和Spo0A對bacillomycin D的合成起正調控作用，而AbrB對bacillomycin D的合成起負調控作用，而ComA和PhrC對bacillomycin D的合成影響不大。
　　4.金屬鹽及其它因素對bacillomyicn D合成

11、的影響
　　研究了Li+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+對bacillomycin D合成的影響。結果表明Ca2+、Mg2+和Na+能顯著提高bacillomycin D產(chǎn)量。Ca2+、Mg2+和Na+的不同金屬鹽對bacillomycin D的合成能力不同。L-乳酸鈣優(yōu)于CaCl2， MgSO4.7H2O優(yōu)于MgCl2，NaCl優(yōu)于Na2CO3.L-乳酸鈣最適合產(chǎn)bacillomycin D的金屬鹽。L-乳

12、酸鈣是最適合產(chǎn)bacillomycin D的金屬鹽。確定搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)bacillomycin D的較適宜條件為:酵母膏3g/L，發(fā)酵時間為120h，溫度為33℃，初始pH7.0和接種量5％。
　　5.Bacillomyicn D高效合成因子優(yōu)選及多輪補料分批發(fā)酵
　　通過Plackett-Burman設計法和響應面分析，發(fā)現(xiàn)，酵母膏、菊糖和發(fā)酵時間對bacillomycin D產(chǎn)量影響極顯著，得出了bacillomycinD

13、高效合成的最佳工藝參數(shù):酵母膏4.52g/L，菊糖42.62g/L和發(fā)酵時間137.5h，在此條件下，得到的bacillomycin D產(chǎn)量為1014.92 mg/L。通過優(yōu)化組合，獲得bacillomyicn D高效合成培養(yǎng)基（YIGL培養(yǎng)基）配方:酵母膏4.52g/L，菊糖42.62g/L，L-Gln5g/L，L-乳酸鈣7g/L。和landy培養(yǎng)基相比，YIGL培養(yǎng)基能顯著提高bacillomycin D的產(chǎn)量。YIGL培養(yǎng)基能上調

14、了BYA、BYB、BYC和TE的表達，增強bacillomycin D合成酶轉錄活性，顯著提高bacillomycin D的合成能力。為了進一步提高bacillomycin D的合成能力，通過控制發(fā)酵液DO和測定生物量的變化確定一輪、兩輪、三輪和四輪補料分批發(fā)酵策略，采用該策略進行補料分批發(fā)酵，能顯著提高bacillomycin D的產(chǎn)量，其中三輪補料分批發(fā)酵獲得的bacillomycin D產(chǎn)量和生物量最大，分別達到3.26g/L和7

15、6.34g/L。
　　6.Bacillomyicn D的赭曲霉抑菌模式研究
　　研究了bacillomycinD對赭曲霉菌絲和孢子生長的影響，結果表明，30μg/mL的bacillomycin D能完全抑制菌絲和孢子生長，赭曲霉的MIC和MFC分別為30μg/mL和90μg/mL。Bacillomycin D能使赭曲霉菌絲產(chǎn)生變形、扭曲，破壞細胞壁和細胞膜，能與赭曲霉基因組DNA結合并破壞基因組DNA，使細胞膜離子通透性增加

16、，造成核酸和蛋白質發(fā)生泄漏。Bacillomycin D能導致赭曲霉細胞凋亡。當采用25μg/mLbacillomycin D處理赭曲霉細胞1和2h時，細胞損傷率由73.7％增加至92.07％。研究了bacilomycin D引起赭曲霉細胞凋亡的因素:ROS的產(chǎn)生和hsp70的表達情況。Bacillomycin D能促進的H2O2產(chǎn)生和減弱赭曲霉抑制產(chǎn)O2-和.OH，當添加25μg/mLbacillomycin D培養(yǎng)7d時，產(chǎn)生的H2

17、O2比對照增加了30.22倍，而O2-抑制量和.OH抑制量分別比對照下降了486.85 U/g蛋白和375.2 U/mg蛋白。H2O2、O2和.OH的累積是導致赭曲霉細胞凋亡的原因之一。Bacillomycin D對hsp70的表達具有上調作用，hsp7D表達量的提高能減緩bacillomycin D對赭曲霉細胞的損傷。
　　7.Bacillomyicn D對OTA的抑制作用及在糧食貯藏中的應用
　　Bacillomycin

18、 D能通過抑制赭曲霉的生長來抑制OTA合成，bacillomycin D濃度越高，抑制效果越明顯。Bacillomycin D能通過下調赭曲霉pks基因的表達、降低OTA合成酶的轉錄活性來抑制OTA合成。人工模擬糧食貯藏實驗結果表明bacillomycin D能有效控制糧食中的赭曲霉污染。當采用90μg/g bacillomycin D，控制谷物水分含量16％、濕度14％和貯藏溫度25℃時，能完全抑制大米和燕麥中赭曲霉的生長和OTA的產(chǎn)