河北省不同地區(qū)糧食赭曲霉毒素A污染情況及OA致細(xì)胞損傷作用的研究.pdf

1、赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是由赭曲菌(Asperegillus alutacells)和純綠青霉(Penicillium viridicatum)產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，包括七種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OA)為主，毒性也最大。OA的分子量為404，熔點169℃，為無色晶體，易溶于有機(jī)溶劑(三氯甲烷和甲醇)和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水。在紫外線照射下OA呈綠色熒光，最大吸收峰為333nm。

2、該化合物相當(dāng)穩(wěn)定，一般的烹調(diào)和加工方法只有部分破壞。動物實驗表明，赭曲霉毒素A具有腎毒性、免疫毒性和致癌、致畸、致突變性。1993年國際癌癥研究中心將赭曲霉毒素A列為可能的人類致癌物。一些國家已報道了從人全血、血清及人奶中檢出赭曲霉毒素A。研究表明，糧食污染是人類赭曲霉毒素 A 暴露的主要途徑。研究分析糧食赭曲霉毒素 A 污染情況對保障食品衛(wèi)生和安全具有非常重要的意義。目前，國外文獻(xiàn)中已有不少糧食赭曲霉毒素 A 污染情況的分析檢測報道，

3、不少國家和國際組織還根據(jù)赭曲霉毒素 A 的污染情況制定了人體赭曲霉毒素 A 攝入量的限制標(biāo)準(zhǔn)。迄今為止，國內(nèi)有關(guān)糧食中赭曲霉毒素A的污染情況報道較少。目前，有關(guān)糧谷中赭曲霉毒素A的檢測方法主要有薄層色譜法(TCL)、酶免疫檢測法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)等。我國谷物和大豆中赭曲霉毒素A的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是 TCL 法，屬于目測半定量法，最低檢出量為10μg/kg，不適用于糧谷中赭曲霉毒素A的準(zhǔn)確測定和居民赭曲霉毒素A的膳

4、食攝入量的暴露評估研究。 為準(zhǔn)確分析我國糧食中OA的污染情況，進(jìn)一步探討OA污染的生物學(xué)意義，本研究對OA的檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠的OA高效液相色譜熒光定量檢測方法。對河北省不同地理環(huán)境的三個地區(qū)糧食中赭曲霉毒素A污染情況進(jìn)行了定量檢測。同時，以細(xì)胞培養(yǎng)、FCM等方法研究了OA對人外周血單個核細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討了OA對人正常腎小管上皮細(xì)胞株(HKC)和人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AT-Ⅱ)細(xì)胞系A(chǔ)

5、549凋亡的誘導(dǎo)作用。在上述工作的基礎(chǔ)上，采用Western Blotting 和免疫組化方法等方法在蛋白水平上對JNK通路在OA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中作用及OA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的機(jī)制進(jìn)行了研究。 本研究共分為五部分 第一部分赭曲霉毒素A檢測方法的建立 目的：建立SPE-C<,18>柱純化和富集-高效液相色譜法熒光檢測糧谷和酒類樣品中赭曲霉毒素A的系列方法。 方法：1用三氯甲烷提取玉米、小麥和大麥樣品中的OA后，經(jīng)C

6、<,18>固相萃取柱凈化處理，以乙腈：水：乙酸(99：99：2)作為流動相，用帶有熒光檢測器的反相高效液相色譜法(激發(fā)波長為333nm，發(fā)射波長為460nm)檢測OA含量；2 選用C<,18>固相萃取小柱(250mg/3ml)，用2ml乙腈和2ml水分別活化C<,18>小柱，30ml酒樣通過C18固相萃取小柱，控制流速30滴/分。再用2ml乙腈溶液洗脫，最后將C<,18>小柱抽干。45℃下氮氣吹干，流動相溶液稀釋至0.5ml，0.45μ

7、m微孔濾膜過濾后取20μL 進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。 第二部分河北省不同地區(qū)糧食中赭曲霉毒素A污染情況研究 目的：分析河北省不同地理環(huán)境地區(qū)居民食用糧食OA污染情況，了解河北省居民OA 的暴露量，揭示其對健康的可能影響，為減少OA污染及其影響奠定基礎(chǔ)。 方法：抽樣檢測河北省不同地理環(huán)境的三個代表性地區(qū)糧食OA污染情況，三個地區(qū)分別為河北省南部邯鄲市磁縣、河北省中部石家莊市贊皇縣和河北省北部塞外地區(qū)張家口市赤城縣

8、。分別入戶采取中南部地區(qū)居民日常食用主糧小麥和北部地區(qū)居民日常食用主糧大麥樣品。采用反相-高效液相色譜法檢測OA含量：用三氯甲烷提取小麥和大麥樣品中的OA后，經(jīng)C<,18>固相萃取柱凈化處理，以乙腈：水：乙酸(99：99：2)作為流動相，用帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀(激發(fā)波長為333nm，發(fā)射波長為460nm)檢測 OA含量。 第三部分赭曲霉毒素A對體外培養(yǎng)HPBMCs增殖與凋亡的研究 目的：探討OA對體外培養(yǎng)HPB

9、MCs 增殖與凋亡的影響，揭示OA暴露對機(jī)體免疫功能的可能作用。 方法：健康獻(xiàn)血員抗凝靜脈血200mL，采用聚蔗糖.泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque density gradient centrifug-ation)分離人外周靜脈血單個核細(xì)胞，接種于含10％胎牛血清，10<'5>U/L 青霉素，100mg/L 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，加入PHA并使其終濃度為300μg/mL，37℃、5％CO<,2

10、>培養(yǎng)24h，更換不含PHA的新的培養(yǎng)液。HPBMCs隨機(jī)分為4組：空白對照組、溶劑對照組、1μmol/L OA和5μmol/L OA實驗組。實驗組分別給予乙醇溶解的OA處理，使其終濃度分別為1μmol/L 和5μmol/L，對照組和溶劑對照組分別給予等體積生理鹽水和乙醇處理。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，常規(guī)收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞定量檢測術(shù)(FCM)檢測HPBMCs細(xì)胞凋亡率和增殖指數(shù)，以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 的表達(dá)。

11、第四部分赭曲霉毒素A對A-549和 HKC 細(xì)胞損傷的研究 目的：探討OA處理對A549和HKC細(xì)胞增殖與凋亡的影響及可能機(jī)制，并觀察OA對體外分離的DNA致?lián)p傷作用。 方法：取對數(shù)生長期A549和HKC細(xì)胞，用10％DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×10<'8>L<'-1>，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，隨機(jī)分為4組：空白對照組、溶劑對照組、1μmol/L OA和5μmol/L OA 實驗組。實驗組

12、分別給予OA 1μmol/L和5μmol/L處理，溶劑對照組和對照組分別給予乙醇和生理鹽水處理，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)24h。采用MTT法檢測A549和HKC細(xì)胞存活率。采用FCM檢測A549和HKC細(xì)胞凋亡率，以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)情況；采用紫外以及熒光光譜法檢測了OA與小牛胸腺和鮭魚精DNA的相互作用形成的DNA加合物。 第五部分 JNK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在赭曲霉毒素A誘導(dǎo)HKC凋亡中的作用 目的：探討JNK

13、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在赭曲霉毒素A誘導(dǎo)HKC 凋亡中的作用，以期進(jìn)一步探討OA誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。 方法 5.1 OA 對HKC細(xì)胞JNK激酶活性和Caspase-3蛋白表達(dá)影響的檢測 實驗分組與處理同論文第四部分有關(guān)OA作用HKC細(xì)胞24h的實驗分組和處理。細(xì)胞處理24h后，離心收細(xì)胞用于相關(guān)指標(biāo)的檢測。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和 Western blot方法檢測HKC細(xì)胞p-JNK水平，JNK和Caspase-3蛋白表

14、達(dá)。 5.2 JNK 抑制劑SP600125預(yù)處理對OA誘導(dǎo)HKC細(xì)胞JNK激酶活性、凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞損傷影響的檢測 選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞(傳代24h后)，隨機(jī)分為空白對照組、溶劑對照組、OA處理組和JNK 阻斷劑組。1μM OA 處理組給予終濃度為1μMOA；JNK 阻斷劑組預(yù)先加入0.5μM SP600125孵育30min后再加入1μMOA；空白對照組加入生理鹽水；溶劑對照組加入乙醇(1：50

15、0)+DMSO(1：30000)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后消化離心收集細(xì)胞。采用Westernblot 方法檢測HKC 細(xì)胞p-JNK水平和Caspase-3蛋白表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率；采用 MTT 比色法檢測HKC 細(xì)胞的存活率。 結(jié)論 1.建立了反相-高效液相色譜法檢測糧谷和酒類樣品中赭曲霉毒素A的系列方法，本方法具有準(zhǔn)確度高、精密度好和靈敏度高等優(yōu)點?？啥繖z測糧谷和酒類樣品中赭曲霉毒素A，檢測結(jié)果準(zhǔn)

16、確可靠，提取凈化過程簡單等優(yōu)點，為食品中赭曲霉毒素A污染情況調(diào)查和居民對赭曲霉毒素A的暴露評估提供了有力的技術(shù)支持和保障。 2.通過對河北省不同地區(qū)居民食用主糧調(diào)查發(fā)現(xiàn)：河北省中南部地區(qū)居民食用小麥中OA的檢出率達(dá)39-34％,北部地區(qū)居民食用的大麥中OA的檢出率達(dá)到35.48％，均明顯高于國內(nèi)已有的研究報道。贊皇縣農(nóng)村居民OA的日暴露量為1.17μg/kg，磁縣農(nóng)村居民OA的日暴露量為0.31μg/kg，張家口赤城農(nóng)村居民OA

17、的日暴露量為3.38μg/kg，超過世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會暫定的容許攝入量?？梢姾颖笔〔煌乩憝h(huán)境居民食用糧食中OA的污染均比較普遍，應(yīng)當(dāng)引起重視。 3.OA可以促進(jìn)體外培養(yǎng)HPBMCs凋亡，上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，但對HPBMCs增殖沒有明顯影響。 4.OA可抑制體外培養(yǎng)A549和HKC細(xì)胞增殖，上調(diào)Caspase-3 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)體外培養(yǎng)A549和HKC細(xì)胞凋亡。OA可能對體外分離的DNA沒