促成骨細(xì)胞增殖的乳鐵蛋白肽制備及其生物信息研究.pdf

1、乳鐵蛋白(Lactoferrin, LF)是一種堿性糖蛋白，主要存在于乳清蛋白中，作為一種新型的骨生長(zhǎng)因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)骨的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程發(fā)揮其功能，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)，相關(guān)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究已引起廣泛關(guān)注。乳鐵蛋白在被人體攝入后，必須經(jīng)過(guò)胃腸道消化吸收，乳鐵蛋白是只能以完整蛋白的形式發(fā)揮促成骨作用，還是經(jīng)過(guò)胃液消化之后產(chǎn)生的分子片段也可發(fā)揮作用或者兩者同時(shí)發(fā)揮作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用模擬胃液對(duì)乳鐵蛋白進(jìn)行不同時(shí)間地消化處理，將其分解成不同分子量的

2、多肽片段，經(jīng)陽(yáng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析對(duì)乳鐵蛋白肽進(jìn)行分離純化，采用MTT法跟蹤監(jiān)測(cè)純化過(guò)程中的樣品促成骨增殖活性，篩選出具有較好促成骨細(xì)胞增殖活性的多肽。同時(shí)，通過(guò)生物信息學(xué)方法將LF的氨基酸序列與已知具有促成骨細(xì)胞增殖活性的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而闡明LF水解片段的結(jié)構(gòu)與其促成骨細(xì)胞增殖活性的關(guān)系，以此推測(cè)LF在經(jīng)過(guò)胃環(huán)境消化后的活性機(jī)制。
　　本研究首先利用模擬胃液水解LF，水解時(shí)間分別為5min、10min、30min、

3、60min、90min、120min、180min和240min。利用SDS-PAGE和Tricine SDS-PAGE電泳分析不同水解時(shí)間產(chǎn)生的LF水解片段的分子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，LF逐漸被水解成小分子量肽段，小分子量肽段濃度逐漸增加。在水解90 min之后水解產(chǎn)物趨于不變，分子量約為5kDa。然后利用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，比較不同時(shí)間點(diǎn)LF水解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響。促細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H5與其他時(shí)

4、間點(diǎn)相比能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。利用陽(yáng)離子交換層析柱SP Sepharose Fast Flow（1.6×10cm）對(duì)H5進(jìn)行分離純化，在pH7.40.05 MPBS緩沖液（鹽濃度）為洗脫液，洗脫流速為3 mL/min的洗脫條件下，分離得到5個(gè)峰，通過(guò)MTT法確定峰5具有較好促成骨細(xì)胞增殖活性。將峰5進(jìn)行凝膠層析Superdex Peptide10/300 GL（1.0 cm×300 mm），在洗脫液為pH7.60.02MPBS緩沖液，

5、洗脫流速為0.5 mL/min的洗脫條件下，分離得到2個(gè)峰，通過(guò)MTT法確定峰5-1具有較好促成骨細(xì)胞增殖活性，利用Tricine SDS-PAGE電泳確定峰5-1中含有兩種組分，分子量分別為9.35 kDa和6.95 kDa。本研究推測(cè)這兩種乳鐵蛋白肽在乳鐵蛋白發(fā)揮促成骨細(xì)胞增殖活性的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。將LF與具有成骨細(xì)胞增殖活性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMP）進(jìn)行生物信息對(duì)比研究