熱處理對(duì)乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)及促成骨細(xì)胞增殖活性的影響.pdf

1、乳鐵蛋白是牛乳中一種重要的堿性蛋白,相關(guān)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究已引起廣泛關(guān)注。乳鐵蛋白(bLF)作為一種新型的骨生長(zhǎng)因子,通過(guò)調(diào)節(jié)骨的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程發(fā)揮其功能,促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)。熱處理在乳制品加工工業(yè)中十分常見(jiàn),但熱處理對(duì)乳鐵蛋白促成骨細(xì)胞增殖活性的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究以新鮮牛乳為原料通過(guò)系列組合技術(shù)純化乳鐵蛋白,通過(guò)圓二色譜、差式掃描量熱等技術(shù)研究經(jīng)過(guò)不同熱處理的bLF的分子結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的變化,并采用MTT法進(jìn)行成骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),考察不同加熱處理?xiàng)l

2、件對(duì)乳鐵蛋白促成骨細(xì)胞增殖活性的影響。
　　本研究首先以鮮牛乳為原料,通過(guò)脫脂、除酪蛋白、SP Sepharose Big Bead陽(yáng)離子交換層析及Superdex200凝膠層析組合方法、超濾濃縮等方法,制備獲得乳鐵蛋白,最終純度為94.71％。進(jìn)而,研究了熱處理對(duì)乳鐵蛋白的分子特性的影響。通過(guò)差示掃描量熱法測(cè)定得到的乳鐵蛋白熱變性溫度為73.1℃。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中的熱處理參數(shù),設(shè)置加熱參數(shù)62~65℃/30min;72℃/10s;

3、85℃/10min;95℃/10min。通過(guò)電鏡觀察和激光粒度儀測(cè)定發(fā)現(xiàn),隨著加熱處理溫度的升高,形成的蛋白聚集體粒徑增大,即bLF發(fā)生自身熱聚集的程度增強(qiáng)。通過(guò)圓二色譜研究了熱處理對(duì)乳鐵蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明,隨著處理溫度的增加,乳鐵蛋白的α-螺旋構(gòu)象逐步轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊構(gòu)象,蛋白質(zhì)分子排列更為有序,分子的結(jié)構(gòu)變得更加緊密,蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性趨勢(shì)明顯增加。通過(guò)熒光分光光度測(cè)定熱處理對(duì)bLF的表面疏水性的影響,結(jié)果表明隨著處理溫度的

4、升高,蛋白表面疏水性先降低再升高,接近變性溫度時(shí),疏水性達(dá)到最低。
　　采用酶原消化法從新生SD大鼠乳鼠顱蓋骨中提取培養(yǎng)成骨細(xì)胞后,采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),比較不同加熱處理?xiàng)l件對(duì)乳鐵蛋白促成骨細(xì)胞增殖活性的影響。顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞形態(tài),多有2~3個(gè)突起,呈長(zhǎng)梭形或三角形。通過(guò)HE染色、堿性磷酸酶染色以及礦化結(jié)節(jié)染色來(lái)鑒定所提取的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。促細(xì)胞增殖研究表明,未加熱乳鐵蛋白能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,且在50~500μg/

5、mL范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系;在24、48、72h不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上LF對(duì)成骨細(xì)胞的作用有所差異。與未加熱乳鐵蛋白相比,經(jīng)過(guò)65℃加熱處理30min和72℃加熱處理10s對(duì)于牛乳鐵蛋白的活性幾乎無(wú)影響;而乳鐵蛋白分別經(jīng)過(guò)85℃處理10min和95℃處理10min后對(duì)于其活性顯著降低,而且與低質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)組相比,熱處理對(duì)高質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白實(shí)驗(yàn)組影響較大。
　　本研究通過(guò)闡述熱處理對(duì)乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及促成骨細(xì)胞增殖活性的影響,為乳鐵蛋白