乳鐵蛋白分子組成對成骨細(xì)胞增殖活性的影響研究.pdf

1、乳鐵蛋白是一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，多種研究表明其具有抗菌、抗病毒、提高免疫力等功能。近年來的研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白具有促骨生長的作用，是一種預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的新型骨代謝調(diào)節(jié)因子。其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系引起了廣泛關(guān)注，因此本研究主要探討乳鐵蛋白分子中結(jié)合的鐵離子、糖基側(cè)鏈的存在以及乳鐵蛋白的片段，對乳鐵蛋白發(fā)揮其成骨活性的影響。
　　本研究以天然牛乳鐵蛋白為原料，通過透析去除和結(jié)合鐵離子，肽N-糖苷酶F（PNGase-F）裂解糖鏈，胃

2、蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解作用，分別制備得到了缺鐵和鐵飽和型乳鐵蛋白、去糖基化乳鐵蛋白以及不同條件下的乳鐵蛋白水解產(chǎn)物。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）確定了最佳脫鐵透析換水次數(shù)為7次，間隔時間為8 h；最佳結(jié)合鐵透析換水次數(shù)為4次，同樣間隔8 h。采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）確定了PNGase-F作用乳鐵蛋白脫除糖鏈的最佳酶解時間為24h。本研究利用酶原消化新生 SD大鼠對成骨細(xì)

3、胞進(jìn)行分離培養(yǎng)、傳代，使用不同分子組成的乳鐵蛋白及乳鐵蛋白肽作用于成骨細(xì)胞，MTT法測定細(xì)胞的增殖情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖方面，低濃度劑量組和中劑量組的天然乳鐵蛋白（Native-LF）和缺鐵型乳鐵蛋白（Apo-LF）要比飽和型乳鐵蛋白（Holo-LF）效果好，而且隨著培養(yǎng)時間的增長，這種優(yōu)勢有擴(kuò)大的趨勢；高濃度劑量組作用后，Apo-LF促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用逐漸落后于Native-LF。鐵離子有抑制成骨細(xì)胞生長的作用。本

4、研究還利用激光共聚焦顯微鏡研究了不同鐵飽和度乳鐵蛋白與成骨細(xì)胞相互作用的情況，結(jié)果表明乳鐵蛋白的鐵飽和度對于乳鐵蛋白是否能夠進(jìn)入成骨細(xì)胞內(nèi)部并無明顯的影響。乳鐵蛋白去糖鏈以后促成骨細(xì)胞增殖活性明顯下降，體現(xiàn)在各個時間點高濃度去糖基乳鐵蛋白的促成骨細(xì)胞增殖活性顯著弱于天然狀態(tài)的乳鐵蛋白，低中濃度去糖基乳鐵蛋白在24 h、48 h沒有顯著地促成骨細(xì)胞增殖活性，中濃度去糖基乳鐵蛋白只在72 h時能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，且糖鏈單獨存在時，并沒