淫羊藿-天然高分子-磷灰石復合支架對成骨細胞增殖的影響.pdf

1、目的：利用中藥淫羊藿(Epimedium，EP)可“補腎陽，強精骨”作用，將其加入到骨基質的要素材料羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)、絲素蛋白(Silkfibroin，SF)、殼聚糖(Chitosan，CS)中，通過低溫冷凍干燥技術制備出HA-SF/CS/EP復合支架材料，研究其對成骨細胞粘附、生長、增殖的影響規(guī)律，為用于骨修復提供理論基礎，并為臨床應用提供可靠依據。 方法：取新生24小時內的Wistar大鼠顱蓋

2、骨，采用改良膠原酶消化法進行成骨細胞原代培養(yǎng)，7夭后對均勻貼壁生長的單層細胞行第一次傳代，并用差速純化法分離成骨細胞和其他雜質細胞，隨后將純化后的成骨細胞進行傳代培養(yǎng)，通過倒置相差顯微鏡、HE染色、堿性磷酸酶改良鈣鈷法染色、鈣結節(jié)茜素紅染色等手段對獲得的細胞進行生物學特性的研究與鑒定。然后取第三代最佳生長狀態(tài)的成骨細胞，按5×104/ml密度接種到HA/CS、HA-SF/CS、HA-SF/CS/EP三種支架材料表面常規(guī)培養(yǎng)，用倒置相差顯

3、微鏡及掃描電鏡觀察細胞形態(tài)，通過堿性磷酸酶活性測定法和MTT法測量出三種支架材料對細胞增殖的影響。 結果： 1、從形態(tài)學上看，經鼠顱蓋骨培養(yǎng)出的成骨細胞呈短梭形或多角形，符合成骨細胞形態(tài)和生長特性。 2、從組織學上看，培養(yǎng)的細胞通過堿性磷酸酶染色，鏡下可見胞漿中棕色至黑色顆粒的為陽性細胞，具有ALP活性；通過茜素紅染色，可觀察到鈣結節(jié)形成，符合成骨細胞鑒定標準。 3、SEM觀察，3天時，HA/CS、HA-

4、SF/CS、HA-SF/CS/EP三種材料表面均有少量成骨細胞粘附，9天時，三種材料表面的成骨細胞量均增多，細胞伸展良好，并有向孔隙內伸展的趨勢。但可見HA/CS-SF-EP組的細胞數量較前兩組多。 4、通過堿性磷酸酶活性測定法，成骨細胞與HA/CS、HA-SF/CS、HA-SF/CS/EP三種支架材料復合后第3至9天分泌的ALP含量呈上升趨勢。3、6、9天不同培養(yǎng)時間細胞內ALP的含量差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。通

5、過MTT比色法，實驗組與對照組相比，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；各實驗組之間相比，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。統(tǒng)計分析表明HA-SF/CS/EP組OD值明顯高于其他實驗組和對照組，提示HA-SF/CS/EP對成骨細胞增殖有明顯促進作用。 結論： 1、通過堿性磷酸酶活性測定法和MTT比色法，表明HA-SF/CS/EP較HA/CS和HA-SF/CS更能促進成骨細胞的增殖；通過SEM觀察，表明HA-SF/CS和HA-SF/