乳鐵蛋白通過IGF-Ⅰ-IGFBPs系統(tǒng)促進原代成骨細胞增殖與分化.pdf

1、目的:
　　觀察不同濃度的乳鐵蛋白(Lactoferrin LF)對原代大鼠成骨細胞增殖、分化及IGF-Ⅰ、IGFBP2基因表達的影響,探討乳鐵蛋白是否呈時間劑量依賴性促進成骨細胞增殖、分化及乳鐵蛋白抗骨質疏松的分子機制,為臨床用藥提供實驗依據。
　　方法:
　　(1)采用胰酶和Ⅰ型膠原酶混合酶消化法從新生乳鼠頭蓋骨中分離原代大鼠成骨細胞,并用堿性磷酸酶染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色鑒定。
　　(2)不同濃度乳鐵蛋白

2、干預成骨細胞,實驗分組為:對照組,LF1(0.1ug/ml),LF2(1ug/ml),LF3(10ug/ml),LF4(100ug/ml),LF5(1000ug/ml),在1,3,5,7天后分別采用噻唑藍(MTT)法測定細胞增殖,通過PNPP法測定其堿性磷酸酶活性反應細胞分化,RT-PCR法檢測IGF-ⅠmRNA,IGFBP2mRNA的表達水平。
　　(3)利用RNA干擾技術,沉默大鼠成骨細胞中IGF-Ⅰ的表達。
　　(4)

3、MTT法和PNPP法檢測乳鐵蛋白干預IGF-Ⅰ基因沉默后的大鼠成骨細胞的增殖、分化。
　　(5)統(tǒng)計學方法:各實驗數據采用x±s表示,應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,各組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P﹤0.05,差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　(1)原代培養(yǎng)的細胞具有成骨細胞的典型特征,堿性磷酸酶染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陽性。
　　(2)MTT法結果顯示:干預第一天,

4、各干預組除LF1組外均明顯高于對照組(p<0.01),各孔吸光度值隨著干預濃度的增大而升高。干預第三天,LF2、LF5組吸光度值較對照組差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),而LF3、LF4組較對照組有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01),干預第五天,LF2、LF3組較對照組有統(tǒng)計學意義(p<0.05),LF4組明顯高于對照組(p<0.01),LF5組則明顯低于對照組(p<0.01),干預第七天,LF2組明顯高于對照組(p<0.01),LF5組明

5、顯低于對照組(p<0.01),而LF3,LF4組雖高于對照組,但無統(tǒng)計學意義。同時,各干預組干預1,3,5,7天,各孔的吸光度值隨著干預時間的延長而上升。
　　(3)PNPP法結果顯示,LF1組對成骨細胞堿性磷酸酶活性無明顯影響。LF2-5均可促進成骨細胞ALP活性。干預第七天LF5組的ALP活性值達到最大。同時,各LF組ALP活性值均隨著時間的延長不斷升高,且第七天顯著高于第1,3,5天。
　　(4)實時熒光定量PCR結果

6、顯示:與對照組比較,干預1天后LF3-5組IGF-ⅠmRNA表達水平顯著升高,LF1-5組IGFBP2 mRNA水平降低(均P<0.01);3天后,LF2組IGF-ⅠmRNA表達水平升高而IGFBP2 mRNA水平降低(均P<0.05),LF3,4,5干預組較對照組IGF-ⅠmRNA表達水平明顯升高而IGFBP2 mRNA顯著降低(均P<0.01);5天后,與對照組比較,各干預組IGF-ⅠmRNA組表達量均顯著升高而IGFBP2 mRN

7、A表達量均顯著下降(P<0.01);7天后,與對照組比較,LF3,4,5組IGF-ⅠmRNA表達量明顯升高,而LF4,5組IGFBP2 mRNA表達量明顯下降,差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　(5)經RNAi干擾使IGF-Ⅰ基因沉默后,RT-PCR結果及western blot結果顯示IGF-Ⅰ基因被沉默。
　　(6)乳鐵蛋白干預IGF-Ⅰ基因沉默后的成骨細胞,檢測其增殖、分化,結果顯示:與正常對照組比較,LF

8、干預組促進成骨細胞增殖、分化(P<0.01),shRNA轉染組,LF+shRNA轉染組抑制成骨細胞增殖、分化(P<0.01),NC組與正常對照組之間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。shRNA轉染組及LF+shRNA轉染組與NC組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。LF+shRNA轉染組與shRNA轉染組比較差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05),與LF干預組比較則差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結論: