PLGA納米粒緩釋系統(tǒng)的建立及其對rhFGF-2和rhBMp-2生物學活性的維持.pdf

1、目的:在節(jié)段性骨缺損修復、四肢關節(jié)重建、脊柱融合等臨床治療中，常需要進行骨移植。自體骨和同種異體骨等骨修復材料因自身固有缺陷而在臨床應用中受到極大限制。人工骨因其可大批量生產(chǎn)、便于儲存運輸?shù)忍攸c，成為近年來骨修復材料領域的研究熱點。目前已有多種類型的人工骨應用于臨床，以磷酸鈣骨水泥、羥基磷灰石和可降解有機材料等為主，主要用于非結(jié)構(gòu)性植骨。但這些人工骨的骨修復效果有限或不佳，遠遜于自體骨或異體骨，其主要原因是不具備骨誘導活性。生長因子可以

2、促進間充質(zhì)干細胞的增殖、分化，可有效促進新骨的形成，將其復合到人工骨支架上，將有望賦予人工骨有效的誘導成骨活性。但生長因子的半衰期很短，直接使用將很快被降解或稀釋，不能在骨修復局部形成有效持久的藥物濃度。不僅使用量大，經(jīng)濟成本高，而且隨血液分布到機體其他部位，可能出現(xiàn)并發(fā)癥。因此，如何構(gòu)建一種有效的生長因子緩釋系統(tǒng)成為該領域發(fā)展需解決的一大關鍵難題。聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)納米粒在藥劑學方面的快速發(fā)展為骨科醫(yī)生帶來了啟示。PLGA

3、是一種人工合成的高分子聚合物，可作為多種藥物的載體而實現(xiàn)體內(nèi)的持久釋放。如果使用PLGA作為載體對生長因子進行負載，則有望實現(xiàn)生長因子在體內(nèi)的緩慢釋放，從而在骨修復局部維持足夠的濃度，充分發(fā)揮它們的促成骨功能。將這個緩釋系統(tǒng)同人工骨主體支架復合，則有望制備出具有較高成骨活性的復合人工骨，來滿足臨床對理想骨修復材料的需求。本課題組擬篩選一種PLGA作為主體材料建立納米粒緩釋系統(tǒng)，對制備條件進行探索優(yōu)化，使之更高效地包封蛋白質(zhì)類物質(zhì)，能有效

4、地保護蛋白質(zhì)的生物學活性，并可穩(wěn)定釋放這些物質(zhì)達一個月以上，為制備出高活性的人工骨修復材料打下基礎。
　　方法:(1)查閱相關文獻，根據(jù)對緩釋系統(tǒng)的實際需求和生長因子的性質(zhì)，最終選擇分子量較低、乳酸與乙醇酸單體比例為50∶50的PLGA作為納米粒制備的主體材料。采用復乳溶劑揮發(fā)法(W/O/W)制備納米粒，以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白，探索PLGA濃度、BSA與PLGA質(zhì)量比、內(nèi)水相與油相體積比、內(nèi)水相溶劑類型等因素對制備PL

5、GA納米粒的影響，通過測定蛋白的包封率并兼顧載藥率來尋找最優(yōu)制備條件。(2)通過優(yōu)化條件制備納米粒，分別研究其對BSA、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)、重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhFGF-2)的體外釋放動力學，評價其對蛋白質(zhì)的緩釋效果。(3)與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，用CCK-8法和live&dead染色來證實PLGA納米粒的生物相容性。(4)利用細胞增殖實驗來驗證rhFGF-2/PLGA納米粒的生物學活性，利用堿性磷酸酶(

6、ALP)染色、ALP活性檢測、骨鈣素(OCN)含量檢測、成骨相關標志物的表達等來驗證rhBMP-2/PLGA納米粒的生物學活性。
　　結(jié)果:(1)成功制備了PLGA納米粒并優(yōu)化了制備條件，當PLGA濃度為200mg/mL、BSA與PLGA質(zhì)量比為1∶40、水油體積比1∶10、內(nèi)水相使用去離子水時可獲得對BSA最理想的包封率和載藥率。(2)制備的納米粒呈規(guī)則球形，粒徑在300 nm左右，對BSA、rhBMP-2、rhFGF-2的包封

7、率分別為(70.0±1.3)％、(68.2±1.7)％、(66.8±2.9)％。(3)納米?？蓪崿F(xiàn)蛋白類物質(zhì)的持久緩慢釋放，長達一個月以上，突釋現(xiàn)象不明顯。(4)納米粒的生物相容性良好，與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)3天，細胞存活力好。(5)rhFGF-2/PLGA納米粒對細胞有明顯促增殖作用，共培養(yǎng)7天后其促增殖作用顯著強于rhFGF-2溶液組(p＜0.05)。ALP染色、ALP活性檢測、骨鈣素含量檢測、成骨相關標志物表達結(jié)果證實rhBMP-2

8、/PLGA納米粒對C2C12細胞具有促成骨分化作用，且顯著強于rhBMP-2溶液組(p＜0.05)。
　　結(jié)論:以優(yōu)化條件制備的PLGA納米粒呈規(guī)則球形，對蛋白質(zhì)的包封效率高，能實現(xiàn)一個月以上的緩慢釋放，具有良好的生物相容性，利用PLGA納米粒負載的rhBMP-2、rhFGF-2仍具有良好的生物學活性，且表現(xiàn)出比直接使用相同劑量的相應生長因子溶液更優(yōu)效的作用。PLGA納米粒適宜作為生長因子的緩釋載體，為賦予人工骨高成骨誘導活性提供