PAMAM樹狀分子復(fù)合rhBMP-2基因活性基質(zhì)的構(gòu)建及其骨再生研究.pdf

1、目的：
　　 目前，利用組織工程技術(shù)增強(qiáng)骨再生已經(jīng)成為骨缺損治療研究的熱點(diǎn)。雖然將生長(zhǎng)因子結(jié)合于材料的方法在誘導(dǎo)組織再生方面取得了進(jìn)展，但普遍存在著生長(zhǎng)因子釋放難控制、易失活、成本高昂等缺點(diǎn)?；蛑委熂夹g(shù)的發(fā)展為解決這些問(wèn)題提供了新的選擇。將具有轉(zhuǎn)染能力的基因載體結(jié)合于組織工程支架材料以構(gòu)建基因活性基質(zhì)成為一種新的策略。在體內(nèi)外釋放、轉(zhuǎn)染和表達(dá)所編碼的生長(zhǎng)因子。本文在研究PAMAM樹狀分子/rhBMP-2質(zhì)粒復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)

2、上，將此復(fù)合物負(fù)載于TCP/I型膠原支架以構(gòu)建基因活性基質(zhì)(GAM)。檢測(cè)這一基因信號(hào)體系的生物相容性和轉(zhuǎn)染能力，觀察其誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的效果，進(jìn)而將其應(yīng)用于骨缺損的動(dòng)物模型，觀察體內(nèi)促骨修復(fù)結(jié)果。探討這一材料體內(nèi)外誘導(dǎo)成骨作用。通過(guò)本研究，以期為今后應(yīng)用這一新的治療手段提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、選取體重小于120g，5～7周的年輕雄性SD大鼠。斷頸椎處死后消毒提取脛骨和股骨骨髓，采用貼壁分離培養(yǎng)法分離血細(xì)胞

3、和原代rMSC。對(duì)第三代rMSC使用脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液和礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行脂肪向及成骨向誘導(dǎo)2至3周，觀察細(xì)胞形態(tài)并分別進(jìn)行蘇丹Ⅲ染色和茜素紅染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)所培養(yǎng)第三代細(xì)胞表面CD29、CD90、CD14、CD31、CD34和CD45的表達(dá)率。
　　 2、將G5dPAMAM和DNA質(zhì)粒按照質(zhì)量比4:1的比例混合反應(yīng)，制備G5dPAMAM/DNA質(zhì)粒復(fù)合微粒。MTT法鑒定不同濃度的復(fù)合物對(duì)rMSC和COS-7細(xì)胞增殖的影響，探討

4、無(wú)明顯毒性下的合理轉(zhuǎn)染濃度。體外對(duì)COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效果。
　　 3、I型膠原的堿性溶液中加入納米β-TCP粉末溶解，冷凍干燥法制備β-TCP/I型膠原復(fù)合多孔支架。將第二章中所制備的dPAMAM-DNA質(zhì)粒復(fù)合物滴加于支架，順序降溫反應(yīng)并冰凍以構(gòu)建GAM。MTT法測(cè)定rMSC在不同質(zhì)粒負(fù)載量的GAM中增殖速率，篩選出最佳的質(zhì)粒復(fù)合物負(fù)載量。比重法測(cè)定兩種材料的孔隙率，掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，Picog

5、reen測(cè)定質(zhì)粒復(fù)合物釋放速率。分別接種rMSC于兩種材料上并連續(xù)培養(yǎng)5天。掃描電鏡觀察材料表面細(xì)胞生長(zhǎng)情況。對(duì)GAM內(nèi)的rMSC熒光染色，激光共聚焦顯微鏡掃描觀察材料內(nèi)部細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)及分布。
　　 4、根據(jù)上一步方法制備含GFP質(zhì)粒的GAM，與rMSC在含血清環(huán)境中共培養(yǎng)3天后取出GAM。DAPI染色細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)率并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。制備含rhBMP-2質(zhì)粒的GAM，接種rMSC并在含血清環(huán)境中連續(xù)體外培養(yǎng)2

6、5天。定時(shí)提取GAM-rMSC共培養(yǎng)物的上清液，ELISA法測(cè)定rhBMP-2濃度，ALP試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中ALP水平變化。探討新建GAM在血清環(huán)境中促成骨應(yīng)用的可行性。
　　 5、取45只成年SD大鼠，全麻下于右側(cè)股骨中段制備5mm長(zhǎng)的全段缺損。分為3組，分別設(shè)定植入GAM、納米β-TCP/I型膠原復(fù)合支架和空白無(wú)植入物組，髓內(nèi)釘固定。連續(xù)12周觀察其存活和術(shù)區(qū)愈合情況，定期進(jìn)行X線檢測(cè)；定期提取血清測(cè)定rhBMP-2、ALP

7、水平；斷頸椎處死動(dòng)物，取術(shù)區(qū)標(biāo)本制備切片，HE染色觀察成骨，免疫組化染色檢測(cè)術(shù)區(qū)rhBMP-2表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、所分離提取的細(xì)胞呈典型貼壁生長(zhǎng)。在成骨向誘導(dǎo)2周后，光鏡下可見白色高折光率的礦化微粒，茜素紅染色陽(yáng)性。脂肪向誘導(dǎo)3周后，光鏡下見細(xì)胞增大，內(nèi)含圓形脂滴，蘇丹Ⅲ染色陽(yáng)性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示細(xì)胞表面CD90和CD29表達(dá)率高達(dá)98％和97%，CD14、CD31、CD34和CD45低表達(dá)。
　　

8、2、G5dPAMAM/DNA質(zhì)粒復(fù)合微粒具有良好的生物相容性，在較低濃度即對(duì)COS-7細(xì)胞表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染能力，高濃度下不利于COS-7細(xì)胞增殖。此復(fù)合物在含血清的體外環(huán)境中能夠有效轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染效果具有一定的時(shí)間累積效應(yīng)。
　　 3、所制備的GAM具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大，孔隙率高。在2周內(nèi)能夠持續(xù)釋放DNA質(zhì)粒復(fù)合物，第6天的釋放量達(dá)到高峰。MTT顯示細(xì)胞在GAM內(nèi)增殖速度快。MSC在GAM中貼壁良好，細(xì)胞形態(tài)正常。

9、激光共聚焦顯示rMSC在GAM的各個(gè)深度均勻浸潤(rùn)分布，呈三維立體生長(zhǎng)。
　　 4、GAM在體外環(huán)境中可有效轉(zhuǎn)染rMSC，所轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)，能夠在10天內(nèi)表達(dá)并分泌所編碼的rhBMP-2。通過(guò)25天的ALP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GAM組培養(yǎng)液中的ALP活性水平高于對(duì)照組和空白組，提示rMSC成骨向分化活性增強(qiáng)。
　　 5、45只大鼠術(shù)后全部存活，創(chuàng)口愈合良好，未見明顯炎癥感染。X線結(jié)果示GAM組于12周內(nèi)完成股骨連續(xù)性的修復(fù)，納

10、米β-TCP/I型膠原復(fù)合支架和空白組均未能完成修復(fù)；ELISA檢測(cè)顯示GAM組動(dòng)物血清的rhBMP-2濃度明顯高于其他2組，ALP水平在早期達(dá)到高峰；HE結(jié)果顯示GAM組的缺損區(qū)較其他2組有更快的骨化過(guò)程，免疫組化顯示在2至4周內(nèi)GAM組能于骨斷段邊緣新生骨區(qū)表達(dá)rhBMP-2。
　　 結(jié)論：
　　 1、貼壁分離培養(yǎng)法從大鼠脛骨和股骨所提取的細(xì)胞具有良好的多向分化潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為骨細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)顯示所培養(yǎng)細(xì)胞高表

11、達(dá)MSC的標(biāo)志抗原，確認(rèn)為rMSC。此細(xì)胞適用于骨組織工程研究。
　　 2、G5dPAMAM/DNA質(zhì)粒復(fù)合物在轉(zhuǎn)染濃度下具有良好的生物相容性和體外轉(zhuǎn)染能力，適合用于基因治療研究。這種復(fù)合物的轉(zhuǎn)染過(guò)程可在含血清環(huán)境中進(jìn)行。
　　 3、納米β-TCP/I型膠原復(fù)合支架和在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的GAM呈疏松多孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙率均大于90%，具有良好的生物相容性，適于rMSC生長(zhǎng)。GAM在體外培養(yǎng)中能夠持續(xù)釋放DNA質(zhì)粒復(fù)合物。