畢赤酵母糖基工程改造及WFDC2生物學活性的探討.pdf

1、甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達系統(tǒng)近年來被廣泛用于外源蛋白的大規(guī)模表達和生產(chǎn)，但其對重組蛋白的糖基化修飾與哺乳動物細胞產(chǎn)生的復雜型糖鏈有著明顯區(qū)別。畢赤酵母合成的糖蛋白為30-50個甘露糖修飾的高甘露糖型蛋白，此類糖蛋白由于末端甘露糖修飾而容易被清除，導致體內(nèi)半衰期縮短，對藥理學性質(zhì)包括生物學活性、受體結合力、抗體效應作用、藥代動力學和免疫原性都有一定的影響，從而限制了畢赤酵母表達系統(tǒng)在藥用重組糖蛋白的表達應用。為了改善畢赤酵母對蛋白的過度糖基

2、化修飾，需要對畢赤酵母的N-糖基化途徑進行改造。本研究的第一部分是根據(jù)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的N-糖基化途徑對畢赤酵母的N-糖基化途徑進行一系列改造，從而獲得能夠產(chǎn)生低糖基化雜合型糖鏈GlcNAcMan5GlcNAc2-Asn修飾的工程菌株。
　　α-1,6甘露糖轉(zhuǎn)移酶(OCH1)是畢赤酵母糖基化途徑中區(qū)別于哺乳動物細胞的第一個關鍵酶，該酶識別Man8GlcNAc2的糖鏈末端并添加α-1,6-甘露糖形成Man9GlcNAc2寡糖連，

3、然后以此寡糖作為底物繼續(xù)添加-系列甘露糖，最終形成高甘露糖型。所以α-1,6甘露糖轉(zhuǎn)移酶(OCH1)是導致高甘露糖型生成的關鍵酶，要阻斷畢赤酵母的過度糖基化修飾，必須對OCH1基因進行敲除，作為畢赤酵母糖基工程改造的起始步驟。首先以野生型畢赤酵母KM71作為起始菌株，建立了MazF-ZeoR兩步基因重組敲除OCH1基因的方法。利用MazF-ZeoR篩選標記和兩步基因重組技術，實現(xiàn)了博萊霉素(zeocin)的循環(huán)使用。最終結合基因型和表型

4、篩選獲得了α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶OCH1基因敲除的工程菌株，糖鏈分析發(fā)現(xiàn)其高甘露糖修飾和不均一性明顯降低，85％的糖鏈為Man8GlcNAc2糖型，說明Pichia Pastoris的過度糖基化被阻斷。
　　當具有Man8GlcNAc2寡糖結構的糖蛋白進入高爾基體后，位于高爾基體的α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ對其進行剪切而形成Man5GlcNAc2結構的糖鏈，該糖型是形成雜合型糖鏈的中間糖型。在畢赤酵母內(nèi)合成具有此結構糖鏈的糖蛋白，

5、需要引入外源的α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ來實現(xiàn)。本研究選擇在精氨酸營養(yǎng)缺陷的畢赤酵母菌株內(nèi)表達綠色木霉來源的α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ（MnsⅠ），使用釀酒酵母a交配因子替換其自身信號肽，該基因在C端融合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列HDEL后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母Koch1(⊿och1)工程菌株中表達，糖鏈分析結果顯示68％糖型為Man5GlcNAc2中間結構，表明綠色木霉MnsⅠ能夠在畢赤酵母中發(fā)揮糖苷酶活性。
　　內(nèi)側高爾基體形成的Man5GlcNAc

6、2糖鏈轉(zhuǎn)入中間高爾基體后，在β-1,2-N-乙酰葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GnTⅠ)的作用下生成雜合型糖鏈GlcNAcMan5GlcNAc2，然后進入外側高爾基體，進一步形成復雜型糖鏈，完成哺乳動物雙天線復雜型N-糖鏈的合成。為了實現(xiàn)β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GnTⅠ)的表達需要引入外源的GnTⅠ，本研究將人源GnTⅠ自身定位信號用釀酒酵母高爾基體定位信號mnn9取代后，在畢赤酵母KMoch1(⊿och1，+mds)中表達，對報告蛋白

7、的糖鏈分析結果表明人源β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GnTⅠ)在畢赤酵母中成功表達，具有催化活性，催化效率為91％，最終成功獲得了能夠合成雜合型糖鏈GlcNAcMan5GlcNAc2-Asn的工程菌株。
　　第二部分是以第一部分的工作為基礎，建立了高效表達WFDC2(whey acidicprotein four-disulfide)重組蛋白的工程菌株，并探討不同糖基化修飾的WFDC2蛋白的生物活性的影響。WFDC2蛋白是

8、由124個氨基酸組成的小分子分泌性糖蛋白，作為本研究N-糖基化改造的報告蛋白。該蛋白是由兩個高度保守的乳清蛋白WAP結構域組成，具有該結構的蛋白可能具有抑菌活性和蛋白酶抑制作用，但WFDC2的生物活性尚未研究報道。本研究首先對哺乳動物細胞293F表達的WFDC2蛋白進行生物學活性研究，然后以其作為對照，對末端不同糖基化修飾（高甘露糖型、雜合型和復雜型）的WFDC2進行生物學活性探索和對比研究。結果顯示W(wǎng)FDC2與多種微生物有一定的親和作

9、用，其中與金黃色葡萄球菌的親和力較強，對其生長有微弱的抑制作用;WFDC2蛋白對多種蛋白酶均有一定的抑制作用，包括絲氨酸蛋白酶（胰酶和彈性蛋白酶）、基質(zhì)金屬蛋白酶和枯草桿菌分泌的蛋白酶，對MMP9的抑制作用較強。末端為高甘露糖型和雜合型糖基化修飾的WFDC2蛋白的生物學活性（包括對枯草蛋白酶、絲氨酸蛋白酶的抑菌作用）降低，其中末端為雜合型糖基化修飾的WFDC2蛋白(KMoGnTⅠ-WFDC2)對胰酶的抑制作用與哺乳動物細胞293F表達的

10、WFDC2蛋白活性相近，說明末端糖鏈的組成對蛋白的生物活性產(chǎn)生一定的影響。
　　綜上所述，經(jīng)過對畢赤酵母的糖基工程改造，最終獲得具有自主產(chǎn)權的，能夠產(chǎn)生雜合型GlcNAcMan5GlcNAc2-Asn糖型的工程菌株KMoGnTⅠ，為進一步合成復雜型糖基提供結構基礎;同時首次在體外發(fā)現(xiàn)WFDC2具有蛋白酶抑制作用，并對末端不同糖基化修飾對WFDC2蛋白生物活性的影響進行探討，對于了解WFDC2的結構和功能的關系，及在生理病理中的作用