蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZα A/M-IL-2(88Arg，125Ala)，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115。篩選多拷貝陽性菌株，甲醇誘導(dǎo)多拷貝陽性菌株表達(dá)融合蛋白，分離純化該融合蛋白，并進(jìn)行抗菌及抗腫瘤生物學(xué)活性研究。
　　方法以質(zhì)粒pET-15 b/M-IL-2(88Arg，125Ala)為模板，PCR獲得目的基因，構(gòu)建重組載體

2、pPICZα A/M-IL-2(88Arg，125Ala);通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115;MMH，MDH篩選Mut+表型陽性菌株GS115; ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法篩選多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，提取上清，SDS-PAGE及BCA法檢測最佳誘導(dǎo)時間，Western blot鑒定抗原性及特異性。經(jīng)硫酸銨分級沉淀法、透析法、鎳離子親和層析純化融合蛋白;液相測定法研究融合蛋白抑菌活性，CCK-8法檢

3、測該融合蛋白抗腫瘤活性。
　　結(jié)果成功構(gòu)建畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化菌株GS115/M-IL-2(88Arg，125Ala)。經(jīng)MDH及MMH篩選出Mut+型重組菌株GS115/M-IL-2(88Arg，125Ala)。ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法成功篩選出兩株多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。SDS-PAGE檢測在26kDa左右有明顯目的條帶，與理論值相符。BCA法測定甲醇誘導(dǎo)120h融合蛋白表達(dá)量達(dá)到最高濃度814.5 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于

4、該融合蛋白存原核系統(tǒng)中產(chǎn)量。Western blot鑒定該融合蛋白具有抗原特異性。經(jīng)硫酸銨分級沉淀法、透析法、鎳離子親和層析法獲得純度為99％的目的蛋白，經(jīng)濃縮管濃縮獲得濃度為432.5mg/L的目的蛋白5 mL。經(jīng)檢測純化的融合蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長活性，具有較強(qiáng)抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞及Hela的生長增殖的生物活性。
　　結(jié)論成功構(gòu)建畢赤酵母分泌表達(dá)重組載休pPICZα A/M-IL-2(88Arg，