應(yīng)用釀酒酵母和畢赤酵母對(duì)水稻DNA甲基轉(zhuǎn)移酶生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、DNA甲基化修飾是存在于多數(shù)真核生物中的一種重要的表觀遺傳修飾,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)在其中起著重要的作用,因此,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。
　　 本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到水稻DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(OsDMT)編碼基因,構(gòu)建水稻DNA甲基轉(zhuǎn)移酶真核表達(dá)載體,然后將其轉(zhuǎn)化到?jīng)]有DNA甲基化背景的釀酒酵母株系A(chǔ)H109中進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)選取人類的DNA從頭甲基化酶DNMT3A、DNMT382作為實(shí)驗(yàn)

2、的陽(yáng)性對(duì)照。利用梯度稀釋的點(diǎn)板(Dotting Assay)研究外轉(zhuǎn)基因?qū)︶劸平湍窤H109生長(zhǎng)狀態(tài)的影響,用綠色熒光蛋白檢測(cè)外轉(zhuǎn)基因在酵母中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:通過菌液PCR、雙酶切鑒定及測(cè)序,得到了正確重組的pBridge DNMT3A、pBridge—DNMT382、pBridge_OsDMT、pBridge_EGFP和pBridge_OsDMT_EGFP,并成功轉(zhuǎn)化到釀酒酵母AHl09中,得到陽(yáng)性單克隆。梯度稀釋的點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)中,

3、陽(yáng)性對(duì)照組DNMT3A和DNMT382對(duì)釀酒酵母AH109產(chǎn)生了生長(zhǎng)抑制,而實(shí)驗(yàn)組OsDMT對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)并無明顯抑制。外轉(zhuǎn)帶有EGFP質(zhì)粒和不帶EGFP質(zhì)粒的菌體在藍(lán)光激發(fā)下均呈綠色,尚不確定外轉(zhuǎn)基因是否被表達(dá)。使用MSAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)隨機(jī)選取的單克隆個(gè)體進(jìn)行全基因組范圍甲基化分析,結(jié)果顯示外轉(zhuǎn)的hDNMT3A、DNMT382和OsDMT使酵母基因組DNA甲基化升高。但也發(fā)生了極個(gè)別去甲基化的現(xiàn)象,這有可能是細(xì)胞分裂過程中產(chǎn)生的序