LncRNA--ncRuPAR對(duì)胃癌的調(diào)控機(jī)制及滋陰化痰方的干預(yù)作用.pdf

1、研究目的:課題組前期發(fā)現(xiàn)lncRNA-ncRuPAR在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，且與胃癌的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤的大小及TNM分期密切相關(guān)，臨床有效方藥“滋陰化痰方”可抑制胃癌細(xì)胞增殖。本課題旨在通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究ncRuPAR與胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制，并驗(yàn)證“滋陰化痰方”是否通過干預(yù)ncRuPAR發(fā)揮其對(duì)胃癌的治療作用，以期深化對(duì)胃癌發(fā)病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為闡釋滋陰化痰方可能

2、的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。
　　研究方法:(1)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real Time PCR，qPCR)技術(shù)檢測(cè)AGS，HGC27，MKN45，MGC8034株胃癌細(xì)胞中ncRuPAR的表達(dá)水平。(2)重組慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分別感染HGC27細(xì)胞，構(gòu)建HGC27過表達(dá)細(xì)胞株HGC27-ncRuPAR及對(duì)照細(xì)胞株HGC27-Empty Vector

3、;重組慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分別感染MGC803細(xì)胞構(gòu)建MGC803干擾細(xì)胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及對(duì)照細(xì)胞株MGC803-Empty Vector，嘌呤霉素2μg/mL篩選72h后形成慢病毒感染表達(dá)穩(wěn)定株，qPCR檢測(cè)各穩(wěn)株中ncRuPAR的表達(dá)量。(3)CCK-8法檢測(cè)ncRuPAR對(duì)胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803增殖的影響;流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析ncRuPAR對(duì)

4、胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察ncRuPAR對(duì)胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803遷移能力的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)觀察ncRuPAR對(duì)胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803侵襲能力的影響。(4)將HGC27-ncRuPAR，HGC27-Empty Vector及HGC27-Control細(xì)胞株分別在裸鼠皮下接種造HGC27皮下移植瘤模型，觀察各組裸鼠一般情況及比較瘤體體積和質(zhì)量，比較ncRuPAR對(duì)HGC

5、27皮下移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響。(5)Affymetrix基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選HGC27-ncRuPAR細(xì)胞株和HGC27-Empty Vector細(xì)胞株之間差異表達(dá)基因，并將芯片分析的差異基因結(jié)果進(jìn)行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis，IPA)分析，推測(cè)ncRuPAR影響胃癌細(xì)胞增殖凋亡的可能通路;Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ncRuPAR對(duì)HGC27和MGC803細(xì)胞中PAR-1蛋白及PI3K/Ak

6、t信號(hào)通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表達(dá)的影響。(6)中藥“滋陰化痰方”干預(yù)HGC27和MGC803細(xì)胞株，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化，觀察滋陰化痰方對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析滋陰化痰方對(duì)胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影響;qPCR檢測(cè)滋陰化痰方對(duì)胃癌細(xì)胞ncRuPAR表達(dá)的影響，觀察滋陰化痰方是否對(duì)ncRuPAR的表達(dá)存在調(diào)控作用;Western blot驗(yàn)證滋陰化痰方對(duì)PAR-1蛋白及PI

7、3K/Akt信號(hào)通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表達(dá)的影響，探究滋陰化痰方可能的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:(1)qPCR結(jié)果顯示:ncRuPAR在HGC27細(xì)胞中低表達(dá)，在MGC803細(xì)胞中高表達(dá)。(2)選擇HGC27細(xì)胞構(gòu)建ncRuPAR過表達(dá)穩(wěn)定株，選用MGC803細(xì)胞構(gòu)建ncRuPAR干擾穩(wěn)定株，qPCR驗(yàn)證ncRuPAR過表達(dá)及干擾穩(wěn)株構(gòu)建成功。(3)CCK-8和流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示:過表達(dá)ncRuPAR可抑制

8、HGC27細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，并促進(jìn)其凋亡，而干擾ncRuPAR表達(dá)則抑制MGC803細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡。劃痕實(shí)驗(yàn)和transwells實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ncRuPAR對(duì)胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803的遷移及侵襲能力影響不顯著。(4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，HGC27-ncRuPAR組與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組裸鼠成瘤減慢，瘤體減小。(5)Western blot結(jié)果顯示:過表達(dá)ncRuPAR使HGC27細(xì)胞中PAR-1、PI3K、p-

9、Akt、CyclinD1蛋白的表達(dá)下降;而干擾ncRuPAR則可使MGC803細(xì)胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表達(dá)升高。(6)中藥“滋陰化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803細(xì)胞，CCK-8和流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示:中藥“滋陰化痰方”可以抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;qPCR結(jié)果顯示滋陰化痰方可以增加胃癌細(xì)胞中ncRuPAR的表達(dá);Western blot結(jié)果顯示滋陰化痰方可以抑制PI3K、p