PKM2對(duì)谷氨酰胺代謝和線粒體損傷的調(diào)控機(jī)制及白藜蘆醇的干預(yù)作用.pdf

1、為應(yīng)對(duì)缺氧和低營(yíng)養(yǎng)條件的腫瘤微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞往往發(fā)生能量代謝的改變，即“代謝重編程”。主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:有氧糖酵解和對(duì)谷氨酰胺的高度依賴。腫瘤細(xì)胞通過(guò)代謝重塑為其生物合成提供大量的中間代謝產(chǎn)物，表明代謝重編程在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中舉足輕重的作用。腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝途徑均受到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，因此探討這兩種代謝途徑間的調(diào)控關(guān)系及其產(chǎn)生原因，將為以腫瘤代謝為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。
　　近年來(lái)，隨著人們對(duì)腫

2、瘤細(xì)胞能量代謝重塑的深入研究，發(fā)現(xiàn)M2型丙酮酸激酶(M2type pyruvate kinase，PKM2)在糖酵解過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。PKM2是糖酵解途徑中將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化成為丙酮酸和ATP的限速酶。已知PKM2在腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)，在協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞葡萄糖相關(guān)代謝途徑（包括糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑）中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但PKM2是否參與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控卻鮮為人知。
　　本研究探討了PKM2與谷

3、氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控之間的關(guān)系，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，為以代謝為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供新思路;進(jìn)一步以PKM2作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，探討了白藜蘆醇對(duì)PKM2的干預(yù)作用及分子機(jī)制，同時(shí)拓展了白藜蘆醇的藥用價(jià)值。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)探討PKM2與谷氨酰胺代謝之間的關(guān)系及其分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，PKM2穩(wěn)定敲低能夠增加谷氨酰胺酶Gls1、Gls2，谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)受體SLC1A5及其上游轉(zhuǎn)錄因子β-cateni

4、n、c-Myc的表達(dá)，而PKM2過(guò)表達(dá)可抑制其表達(dá)，表明β-catenin/c-Myc信號(hào)通路介導(dǎo)PKM2對(duì)谷氨酰胺代謝的調(diào)控。放線菌素D實(shí)驗(yàn)顯示，PKM2上調(diào)β-catenin的表達(dá)主要是通過(guò)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，而不是通過(guò)抑制mRNA降解。檢測(cè)PKM2不同點(diǎn)突變細(xì)胞株中β-catenin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)R399E突變細(xì)胞能明顯抑制β-catenin的表達(dá)，即二聚體形式的PKM2發(fā)揮關(guān)鍵作用。PKM2過(guò)表達(dá)上調(diào)miR-200a的表達(dá)，miR-2

5、00a可與β-catenin的3'UTR結(jié)合抑制β-catenin的表達(dá)。
　　(2)探討PKM2與線粒體功能之間的關(guān)系。采用線粒體探針標(biāo)記PKM2過(guò)表達(dá)及敲低的細(xì)胞中的線粒體，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PKM2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中線粒體圍繞細(xì)胞核分布，融合線粒體的比例升高，線粒體數(shù)量減少。而PKM2敲低后，線粒體分裂為更小的單位，數(shù)量增多。qPCR和western blot結(jié)果顯示PKM2過(guò)表達(dá)后，線粒體分裂蛋白Drp1表達(dá)減少，融合蛋白Mfn2

6、表達(dá)升高;PKM2敲低后，Drp1表達(dá)升高，Mfn2表達(dá)降低;同時(shí)，PKM2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致ATP生成量減少，線粒體DNA拷貝數(shù)增加，電子傳遞鏈復(fù)合物的表達(dá)下降。
　　(3)探討PKM2通過(guò)Drp1調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)平衡的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示PKM2過(guò)表達(dá)能夠在蛋白水平抑制p53表達(dá)，PKM2敲低促進(jìn)其表達(dá)，而對(duì)p53mRNA水平?jīng)]有影響。采用p53siRNA處理細(xì)胞后，Drp1隨p53表達(dá)的下降而下降，表明PKM2能夠通過(guò)p53調(diào)控Dr

7、p1的表達(dá)。蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)提示，PKM2過(guò)表達(dá)促進(jìn)了p53通過(guò)蛋白酶體途徑降解，而PKM2敲低可增加p53蛋白的穩(wěn)定性，該過(guò)程是通過(guò)MDM2介導(dǎo)的p53泛素化實(shí)現(xiàn)的。免疫共沉淀及GST pull-down實(shí)驗(yàn)表明，PKM2與p53、MDM2存在相互作用，推測(cè)PKM2與MDM2可結(jié)合到p53不同的結(jié)構(gòu)域形成三元復(fù)合物促進(jìn)p53的泛素化，進(jìn)而通過(guò)蛋白酶體途徑被降解。免疫組化檢測(cè)宮頸癌病人臨床樣本中PKM2和Drp1的表達(dá)，結(jié)果顯示PKM2與

8、Drp1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與細(xì)胞水平得到的結(jié)果是一致的。
　　(4)探討PKM2通過(guò)Mfn2調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)平衡的分子機(jī)制。研究表明PKM2過(guò)表達(dá)能夠抑制miR-106b的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-106b可以直接靶向Mfn23'UTR，進(jìn)而抑制Mfn2的表達(dá)。采用miR-106b模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Mfn2的表達(dá)水平顯著降低，融合線粒體的數(shù)量及mtDNA拷貝數(shù)減少，ATP生成量升高。免疫組化檢測(cè)乳腺癌病人臨床樣本中PK

9、M2和Mfn2的表達(dá)，結(jié)果顯示PKM2與Mfn2的表達(dá)呈正相關(guān)，這與細(xì)胞中所得結(jié)果是一致的。
　　(5)探討白藜蘆醇對(duì)PKM2的干預(yù)作用及分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過(guò)靶向抑制PKM2的表達(dá)發(fā)揮其抗腫瘤活性。白藜蘆醇處理后導(dǎo)致線粒體分裂成更小、更多的線粒體，且Drp1和Fis表達(dá)明顯升高，Mfn2的表達(dá)顯著下降，PKM2過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象;另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵分子GRP78、CHOP和Caspase12顯著上升，PKM2過(guò)

10、表達(dá)后其表達(dá)明顯逆轉(zhuǎn)。檢測(cè)PKM2敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株中上述指標(biāo)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)及線粒體分裂蛋白表達(dá)上調(diào)，線粒體融合蛋白表達(dá)下降。以上結(jié)果表明PKM2介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體分裂參與白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-326可直接與PKM2的3'UTR結(jié)合，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白藜蘆醇能夠通過(guò)上調(diào)miR-326有效抑制PKM2的表達(dá)。
　　綜上所述:PKM2缺失可通過(guò)激活β-catenin/c-Myc信號(hào)通路