化痰降濁方干預(yù)高脂血癥痰濁證ApoE---小鼠作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　以ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象，采用高脂飼料喂養(yǎng)，建立高脂血癥痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型，通過血脂檢測及定量分析肝臟AMPKα、SREBP-1c、PPARα及其下游相關(guān)代謝酶的基因、蛋白表達(dá)量，探究化痰降濁方對(duì)高脂血癥痰濁證ApoE-/-小鼠的降脂作用及對(duì)肝臟脂質(zhì)合成、脂質(zhì)氧化作用的影響。
　　方法:
　?。ㄒ唬└咧Y痰濁證ApoE-/-小鼠動(dòng)物造模及化痰降濁方干預(yù)
　　選用6周齡雄性ApoE-/-

2、小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后根據(jù)體重隨機(jī)分成對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組2組，對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料喂養(yǎng)，造模期為4周。造模結(jié)束后（第6周末）采血進(jìn)行血脂四項(xiàng)檢測，判斷高脂血癥動(dòng)物模型是否建立。實(shí)驗(yàn)組小鼠根據(jù)血清TC水平隨機(jī)分成5組，分別為模型組、中藥高、中、低劑量組及西藥陽性對(duì)照組。
　　6組小鼠根據(jù)體重進(jìn)行藥物灌胃4周。灌胃結(jié)束后（第10周末）小鼠空腹采血、取材，檢測血脂水平及肝臟、主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積情況。
　　

3、（二）化痰降濁方干預(yù)高脂血癥痰濁證ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)代謝作用動(dòng)物處死后，采集6組小鼠的肝臟新鮮樣品保存。隨機(jī)選取6組小鼠的若干個(gè)肝臟樣本進(jìn)行檢測，通過定量分析探究化痰降濁方對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟SREBP-1c介導(dǎo)的脂質(zhì)合成、PPARα介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化作用的影響。
　　1.采用Q-PCR技術(shù)檢測6組肝臟標(biāo)本的SREBP-1c及其下游生脂酶基因ACC、FAS、SCD-1，PPARα及下游脂質(zhì)過氧化基因CPT-1的基因表達(dá)量;

4、
　　2.采用Western B1ots技術(shù)檢測SREBP-1c及其下游生脂酶ACC，PPARα，AMPKα、p-AMPKα及下游靶蛋白p-ACC的蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬└咧YApoE-/-小鼠動(dòng)物造模及化痰降濁方干預(yù)結(jié)果
　　1.基線分析結(jié)果:
　　(1)初始分組后體重基線:適應(yīng)性喂養(yǎng)后，對(duì)照組體重(18.49±1.29)g，實(shí)驗(yàn)組體重(17.95±1.42)g，2組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義(P＞0.05)，提示兩組基線具有可比性。
　　(2)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分組情況:高脂飼料喂養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)組按照TC水平隨機(jī)分成5組，5組TC、TG、LDL-C、體重之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果提示:隨機(jī)分組較理想，各組具有可比性。
　　2.高脂血癥造模情況分析:造模期結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行血脂水平、飲食與飲水量、體重比較。
　　(1)血脂四項(xiàng)檢測結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組TC增高1倍，TG增高2倍，LDL-C增

6、高了15倍，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示高脂血癥造模成功。
　　(2)小鼠的飲食量結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組飲食量明顯下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示實(shí)驗(yàn)組小鼠存在明顯的厭食癥狀。
　　(3)小鼠的飲水量結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組的飲水量輕微下降，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(4)小鼠的體重結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組高脂飼料喂養(yǎng)4周后體重增加，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

7、5)。
　　3.化痰降濁方降脂作用評(píng)價(jià):
　　(1)給藥后一般情況:
　?、?組的飲食量、飲水量結(jié)果:高脂飼料喂養(yǎng)的5組小鼠飲食量明顯降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;飲水量也下降，其中以中藥低、高劑量組明顯，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　中藥中、低劑量組飲食量下降，中藥高劑量組升高，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);中藥高中低3個(gè)劑量組及陽性對(duì)照組飲水量

8、減少，其中中藥3個(gè)劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)的5組小鼠飲食量下降，存在明顯厭食癥狀。
　?、诮K末體重結(jié)果:中藥高中低劑量組終末體重下降，其中中低、中高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示化痰降濁方具有降低小鼠體重的作用。
　?、鄹闻K濕重結(jié)果:高脂喂養(yǎng)的5組小鼠肝臟濕重增加，其中模型組、陽性對(duì)照組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中

9、藥高中低劑量組、陽性對(duì)照組肝臟濕重減輕，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟濕重明顯增加，化痰降濁方可改善這一癥狀。
　　(2)給藥后血脂水平情況:高脂喂養(yǎng)的5組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示高脂血癥動(dòng)物模型穩(wěn)定。
　　中藥高中低劑量組TC水平升高，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。中藥高中低劑量組TG水平

10、升高，其中，中藥低劑量組小鼠與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中藥高中劑量組LDL-C水平升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示:化痰降濁方降低血脂水平作用不明顯。
　　(3)肝臟HE染色結(jié)果:6組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不清或消失，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含大量脂肪空泡，核居于正中，肝血竇擴(kuò)張，可見大量紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。具體表現(xiàn)為:對(duì)照組內(nèi)肝臟脂肪變性較輕，模型組小鼠肝臟出現(xiàn)大面積壞死，成片狀，有大量淋巴

11、細(xì)胞浸潤。中藥組小鼠肝臟隨著給藥劑量的增加，肝小葉結(jié)構(gòu)愈見明顯，壞死面積減少，脂肪變性減輕，多見肝血竇內(nèi)充血。陽性對(duì)照組小鼠肝臟存在部分壞死，壞死區(qū)內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤，肝血竇擴(kuò)張充血。結(jié)果提示化痰降濁方可減輕小鼠肝臟脂肪變性程度，改善肝臟損傷及壞死。
　?。ǘ┗到禎岱綄?duì)ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響
　　1.化痰降濁方對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)合成的影響:
　　定量檢測6組小鼠肝臟SREBP-1c及其下游生

12、脂酶ACC、FAS、SCD-1的基因、蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示:模型組小鼠肝臟SREBP-1c基因表達(dá)量升高，蛋白表達(dá)量略低，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;下游生脂酶基因ACC、FAS表達(dá)量升高，SCD-1表達(dá)量降低，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠肝臟內(nèi)SREBP-1c介導(dǎo)的脂質(zhì)合成過程無升高。
　　中藥低劑量組小鼠肝臟SREBP-1c基因表達(dá)量明顯升高，與模型組比

13、較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但SREBP-1c蛋白表達(dá)量升高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);ACC、FAS基因表達(dá)量也出現(xiàn)升高，SCD-1基因表達(dá)量出現(xiàn)輕微下降，與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。中藥中劑量組、中藥高劑量組小鼠肝臟內(nèi)SREBP-1c、ACC、FAS、SCD-1基因表達(dá)量下降，SREBP-1c、ACC蛋白表達(dá)量略微升高，與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)果提

14、示化痰降濁方具有降低ApoE-/-小鼠肝臟內(nèi)生脂基因表達(dá)的趨勢。
　　2.化痰降濁方對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)氧化的影響:
　　定量檢測并分析化痰降濁方對(duì)肝臟PPARα及下游脂質(zhì)過氧化酶CPT-1表達(dá)量的影響，結(jié)果表明:模型組小鼠肝臟PPARα蛋白表達(dá)量、CPT-1基因表達(dá)量升高，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)，結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)氧化作用有升高趨勢。
　　中低劑量組PPARα基

15、因、蛋白表達(dá)量，CPT-1基因表達(dá)量升高，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中藥中、高劑量組PPARα、CPT-1基因表達(dá)量、PPARα蛋白表達(dá)量隨著中藥劑量增大而逐漸降低，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。
　　結(jié)果提示:化痰降濁方具有抑制ApoE-/-小鼠肝臟內(nèi)PPARα介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化的趨勢。
　　3.化痰降濁方對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟AMPKα磷酸化的影響:
　　定量檢測6組小鼠肝臟內(nèi)

16、AMPKα、p-AMPKα、p-ACC蛋白表達(dá)量，分析化痰降濁方對(duì)AMPKα磷酸化的影響。結(jié)果顯示:模型組AMPKα、p-AMPKα、p-ACC蛋白表達(dá)量略微升高，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　中藥高中低劑量組p-AMPKα蛋白表達(dá)量、p-AMPKα/AMPKα比值升高，p-ACC蛋白表達(dá)量降低，與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)果提示化痰降濁方具有促進(jìn)AMPKα磷酸化的趨勢。

17、
　　結(jié)論:
　　（一）高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠4周能造成嚴(yán)重的高脂血癥，所造模型為混合型高脂血癥。高脂血癥小鼠具有明顯肥胖癥狀，化痰降濁方可減輕這一癥狀。
　?。ǘ┗到禎岱娇梢员Ｗo(hù)肝臟，減小肝臟壞死面積、減輕肝臟損傷程度，降低肝臟脂肪變性范圍。
　?。ㄈ┗到禎岱骄哂薪档虯poE-/-小鼠肝臟內(nèi)生脂基因表達(dá)的趨勢，可能能夠抑制肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成;同時(shí)具有促進(jìn)AMPKα磷酸化的趨勢，可能能夠促進(jìn)脂質(zhì)代謝，