同源異形框基因PRX-2調(diào)控人表皮干細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的:孕中期胎兒的皮膚創(chuàng)傷后以再生方式進(jìn)行修復(fù)，而成人皮膚創(chuàng)面以瘢痕方式愈合。既往研究發(fā)現(xiàn)，同源異形框基因PRX-2在胎兒和成人皮膚及創(chuàng)面修復(fù)過程中的表達(dá)存在顯著差異。表皮干細(xì)胞(ESCs)與正常皮膚更新生長和創(chuàng)面修復(fù)密切相關(guān)，在胎兒時期的ESCs主要分布在真皮乳頭層，成人主要位于表皮基底層和毛囊隆突部，上述胎兒或成人皮膚ESCs主要分布的區(qū)域正是PRX-2基因陽性表達(dá)的位置?；谝陨涎芯窟M(jìn)展，可以推測PRX-2和ESCs之間以及與胎兒

2、和成人皮膚創(chuàng)傷修復(fù)方式的不同存在某種關(guān)系。因此，本研究使用慢病毒載體介導(dǎo)的PRX-2基因過表達(dá)成人ESCs和慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA沉默胎兒ESCs的PRX-2基因，改變胎兒ESCs和成人ESCs中PRX-2基因的表達(dá)，觀察其細(xì)胞增殖的變化情況，從正、反兩個方向研究PRX-2基因在人ESCs增殖中的作用，為從發(fā)育生物學(xué)角度進(jìn)行創(chuàng)面再生修復(fù)機制的研究提供理論和方法學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采集水囊引產(chǎn)的健康孕20～28周

3、齡胎兒背部的全層皮膚，成人皮膚主要來自在本院泌尿外科24小時內(nèi)行包皮環(huán)切術(shù)的患者。Dispase酶分離表皮和真皮，胰酶消化法得到表皮細(xì)胞懸液，Ⅳ型膠原粘附法獲得人ESCs，倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫熒光染色法/流式鑒定細(xì)胞的表面標(biāo)志物β1整合素、K19、P63、K7和K10。
　　2.CCK-8法檢測胎兒ESCs和成人ESCs的增殖活性，實時定量PCR檢測細(xì)胞中PRX-2基因的表達(dá)。取生長狀態(tài)良好的第2代胎兒

4、ESCs和成人ESCs，使用慢病毒載體介導(dǎo)的PRX-2基因過表達(dá)成人ESCs和慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA沉默胎兒ESCs中的PRX-2基因。轉(zhuǎn)染3～4天后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況，接著應(yīng)用Western blot法檢測病毒轉(zhuǎn)染情況。確認(rèn)導(dǎo)入目標(biāo)基因后，采用CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線，檢測胎兒ESCs和成人ESCs的增殖情況，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。
　　結(jié)果:
　　1.采用Ⅳ型膠原黏附法獲得胎兒E

5、SCs和成人ESCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得的兩種細(xì)胞陽性表達(dá)ESCs的表面標(biāo)志物。胎兒ESCs和成人ESCs的體積均較小，近乎圓形，但胎兒ESCs的體積較成人ESCs的體積更小，二者均呈典型的“鋪路石樣”和克隆性生長。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胎兒ESCs和成人ESCs的細(xì)胞核均較大，核仁較明顯，胞漿較少。綜合以上結(jié)果確定分離得到的細(xì)胞是ESCs。
　　2.胎兒ESCs的增殖速率顯著快于成人ESCs，并且胎兒ESCs中PRX-2基因的表達(dá)

6、高于成人ESCs;病毒轉(zhuǎn)染后的ESCs在熒光顯微鏡下可觀察到GFP的表達(dá);Western blot檢測結(jié)果顯示，PRX-2基因過表達(dá)成人ESCs組的PRX-2蛋白表達(dá)上調(diào)， PRX-2基因沉默胎兒ESCs組的PRX-2蛋白表達(dá)下調(diào)。生長曲線結(jié)果顯示，與成人ESCs對照組相比，PRX-2基因過表達(dá)成人ESCs組的增殖速度顯著增加;PRX-2基因沉默的胎兒ESCs組與胎兒ESCs對照組相比，其增殖速度顯著降低。細(xì)胞周期結(jié)果表明，PRX-2基