Hoxa5對(duì)脂肪細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞的增殖與凋亡是生物體生長(zhǎng)和發(fā)育的重要基礎(chǔ)。脂肪組織的發(fā)育與沉積包括兩個(gè)不同的過(guò)程:脂肪細(xì)胞數(shù)目增多和體積增大。而脂肪過(guò)度沉積會(huì)造成一種非健康狀態(tài)，除了由于能量代謝的紊亂，還要?dú)w因于脂肪細(xì)胞正常增殖和凋亡程序受損。Hoxa5作為Hox家族重要成員之一，其編碼蛋白是與發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)Hox家族成員調(diào)節(jié)人體白色與棕色脂肪發(fā)育，并且在身體不同部位脂肪組織中的表達(dá)有很大差異;Hoxa5的甲基化水平調(diào)節(jié)著小鼠不同部位脂肪細(xì)胞的分

2、化。所以，本研究推測(cè)Hoxa5也有可能參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的增殖與凋亡。然而，近年來(lái)關(guān)于Hoxa5的研究主要集中在癌細(xì)胞上，關(guān)于其對(duì)脂肪細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。本研究中，在脂肪細(xì)胞中超表達(dá)或干擾Hoxa5，運(yùn)用CCK-8、EdU染色、Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI染色、TUNEL染色、JC-1染色、流式細(xì)胞術(shù)、棕櫚酸和血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模型、RT-PCR和Western Blot、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等方法

3、和技術(shù)，系統(tǒng)研究了Hoxa5在脂肪細(xì)胞增殖與凋亡過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.Hoxa5通過(guò)增加細(xì)胞周期阻滯抑制脂肪細(xì)胞增殖
　　細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，超表達(dá)Hoxa5顯著減少增殖過(guò)程中脂肪細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，超表達(dá)組中G0/G1期的細(xì)胞所占比例顯著升高，而S期細(xì)胞比例顯著下降，同時(shí)復(fù)制期中核內(nèi)DNA含量也明顯減少(P＜0.05);RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，

4、超表達(dá)Hoxa5抑制促增殖相關(guān)基因PCNA、Cyclin E、CyclinD的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期抑制因子p27、p53的表達(dá)(P＜0.05)，干擾Hoxa5同以上結(jié)果呈相反趨勢(shì)。說(shuō)明Hoxa5增加周期阻滯進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞增殖。深入研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)Hoxa5顯著降低JAK2/STAT3信號(hào)通路中關(guān)鍵因子JAK2、STAT3的磷酸化水平，并伴隨著周期蛋白Cyclin E表達(dá)下調(diào)，周期抑制蛋白p53表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，說(shuō)明Hoxa5通過(guò)抑

5、制JAK2/STAT3通路增加細(xì)胞周期阻滯。
　　2.Hoxa5通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡
　　Hoxa5顯著增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量，顯著促進(jìn)了脂肪細(xì)胞早期和晚期凋亡的發(fā)生，加劇了基因組DNA的片段化程度(P＜0.01)。JC-1熒光探針?lè)ńY(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，超表達(dá)Hoxa5顯著降低線粒體膜電位，顯著提升了Cyt-c的蛋白表達(dá)(P＜0.05);RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，超表達(dá)Hoxa5顯著上調(diào)

6、線粒體途徑促凋亡基因Bax、Bid、Bad表達(dá)，顯著下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)，增加了Caspase-9、Caspase-3的切割活性(P＜0.05)，干擾Hoxa5同以上結(jié)果呈相反趨勢(shì)。綜上結(jié)果說(shuō)明，Hoxa5促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡，并且主要通過(guò)線粒體途徑。利用棕櫚酸和血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模型進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Hoxa5加劇了模型下脂肪細(xì)胞凋亡的程度。另外，深入研究發(fā)現(xiàn)，在Hoxa5調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中Akt/mTORC1/S6K1

7、通路也參與其中。
　　3.Hoxa5通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞增殖與凋亡
　　利用生物信息學(xué)手段對(duì)增殖和凋亡相關(guān)基因啟動(dòng)子上的Hoxa5轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)周期蛋白的基因中，Ccne1啟動(dòng)子區(qū)域有Hoxa5的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn);在線粒體途徑凋亡相關(guān)基因中，Bax啟動(dòng)子區(qū)域有Hoxa5的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Hoxa5負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控Ccne1，正轉(zhuǎn)錄調(diào)控Bax，進(jìn)一步證明了Hoxa5通