ATRA對K562細(xì)胞中HOXA5基因表達(dá)的影響及其與細(xì)胞周期、凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、目的:本課題旨在通過全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid，ATRA)對人髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞的干預(yù)來分析同源盒基因(Homeobox genes，HOX)A5的表達(dá)變化及其與凋亡率、細(xì)胞周期的關(guān)系，探討HOXA5在髓系白血病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。為臨床治療白血病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人髓系白血病細(xì)胞K562細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　2.細(xì)胞增殖-

2、毒性實(shí)驗(yàn)(Cell Counting Kit-8，CCK-8):測定用不同濃度的ATRA干預(yù)K562細(xì)胞24h、48h、72h、96h后，對K562細(xì)胞的增殖抑制情況，以確定ATRA干預(yù)K562細(xì)胞的最佳濃度值。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:取對數(shù)生長期細(xì)胞(約105/ml)，將K562細(xì)胞隨機(jī)分為ATRA干預(yù)組（實(shí)驗(yàn)組）和對照組。實(shí)驗(yàn)組設(shè)立三個(gè)時(shí)間亞組，以10.0 umol/L的ATRA分別干預(yù)24h、48h和72h;對照組用培養(yǎng)基代替A

3、TRA，其余同ATRA干預(yù)組。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測:測定10.0 umol/L ATRA分別干預(yù)K562細(xì)胞24h、48h、72h后，各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　5.流式細(xì)胞分析儀檢測:檢測并分析10.0 umol/L ATRA干預(yù)K562細(xì)胞不同時(shí)間后，與相應(yīng)的對照組相比細(xì)胞周期分布的變化。
　　6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測:測定10.0 umol/LATRA干預(yù)K562細(xì)胞24h、48h、72h

4、后，細(xì)胞中HOXA5mRNA的表達(dá)情況，并分析HOXA5mRNA的表達(dá)與細(xì)胞周期、凋亡的關(guān)系。
　　7.蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測:測定10.0 umol/L ATRA干預(yù)K562細(xì)胞24h、48h、72h后細(xì)胞中HOXA5蛋白的表達(dá)情況，并分析HOXA5蛋白表達(dá)與細(xì)胞周期、凋亡的關(guān)系。
　　8.統(tǒng)計(jì)方法分析:將實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS17.0軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩變量間相關(guān)性分

5、析采用Spearman等級相關(guān)分析檢驗(yàn)，a=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.CCK-8結(jié)果顯示:ATRA可以抑制K562細(xì)胞的增殖，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，OD值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ATRA干預(yù)濃度為7.5umol/L、10.0 umol/L時(shí)，各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長趨勢最佳。本實(shí)驗(yàn)最終選取10.0 umol/L作為干預(yù)藥物濃度。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋

6、亡率明顯高于對照組(P＜0.05)，且各實(shí)驗(yàn)組隨著藥物干預(yù)時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加(P＜0.05)。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布顯示:ATRA干預(yù)K562細(xì)胞24h、48h、72h后，G0/G1期比例增高，S期比例降低，細(xì)胞增殖周期被阻抑在G0/G1期，細(xì)胞增殖受到抑制。
　　4.RT-PCR結(jié)果顯示:K562細(xì)胞中可以檢測到HOXA5 mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組HOXA5 mRNA的表達(dá)量較對照組升高(P＜0.

7、05)，且隨著干預(yù)時(shí)間延長各實(shí)驗(yàn)組間HOXA5 mRNA的表達(dá)量也逐漸增加(P＜0.05)。
　　5.Western Blot結(jié)果顯示:HOXA5蛋白高表達(dá)于K562細(xì)胞中，ATRA干預(yù)組表達(dá)量較正常對照組高(P＜0.05)，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長HOXA5蛋白的表達(dá)量逐漸升高(P＜0.05)。
　　6.HOXA5的表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡相關(guān)性顯示:K562細(xì)胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性經(jīng)Spearm