抑制素對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、抑制素(inhibin，INH)主要是卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，它通過(guò)內(nèi)分泌和局部作用的方式調(diào)節(jié)動(dòng)物的卵泡發(fā)育，是調(diào)節(jié)家畜繁殖力的重要生殖激素之一。體外培養(yǎng)卵泡顆粒細(xì)胞不僅可以從分子水平研究其凋亡、增殖和類(lèi)固醇激素分泌合成的機(jī)制，而且是探討卵泡發(fā)育排卵及其閉鎖等重要生殖過(guò)程的必要研究模型。本文選用1-1.5歲的小尾寒羊，從3～7mm的卵泡中分離卵巢顆粒細(xì)胞，分為兩個(gè)處理組:干擾組（脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)染）和抑制素A添加組，通過(guò)熒

2、光定量RT-PCR、流式細(xì)胞儀檢測(cè)和酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)等方法，研究RNA干擾抑制素α亞基(INHα)基因的表達(dá)和添加抑制素A對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、雌二醇(E2)和孕酮(P)分泌及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探討卵泡抑制素對(duì)卵泡發(fā)育的局部調(diào)節(jié)作用及作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞的分離與鑒定結(jié)果顯示，分離的綿羊卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，獲得了純度大于96％的顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，滿(mǎn)足進(jìn)一步試驗(yàn)要求;并且

3、成功合成了靶向INHα基因的siRNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染綿羊顆粒細(xì)胞，篩選出siINHα2為最佳干擾效果的siRNA，沉默效率達(dá)85％以上。
　　2.siRNA干擾INHα基因的表達(dá)對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)基因的影響研究結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，干擾INHα基因的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖;轉(zhuǎn)染48h，細(xì)胞周期的分布發(fā)生改變，G1細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.05);細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1和CyclinB

4、1的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而p21的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞凋亡通路中的促凋亡因子Bax、p53和Caspase3的mRNA表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，而抗凋亡因子Bcl-2的mRNA表達(dá)量不受影響。
　　添加抑制素A對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)基因的影響研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，添加抑制素A促進(jìn)細(xì)胞增殖;抑制素A處理顆粒細(xì)胞48h，S期細(xì)胞比例

5、顯著降低（P＜0.05），G2期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05）;細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD1的mRNA水平顯著降低，CyclinB1和細(xì)胞周期抑制因子p21的mRNA水平分別顯著升高.(P＜0.05);顯著抑制細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡通路中Bcl-2、Bax和p53的mRNA表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，Caspase3的mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異。
　　3.siRNA干擾INHα基因的表達(dá)對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞E2和P分

6、泌及相關(guān)基因的影響研究結(jié)果表明，siRNA轉(zhuǎn)染綿羊顆粒細(xì)胞24h、48h和72h后，與陰性對(duì)照相比，E2和P的分泌量均顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染48h后，E2和P相關(guān)基因3β-HSD、StAR和CYP19的mRNA表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，CYP11的表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);顆粒細(xì)胞中抑制素亞基(INHβA和INHβB)、活化素受體(ACVR2A)和繁殖相關(guān)基因（FSHR）的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)

7、，而FST基因的mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　　添加抑制素A對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞E2和P分泌及其相關(guān)基因的影響研究結(jié)果表明，不同濃度抑制素A(0，50，100，200ng/mL)處理綿羊顆粒細(xì)胞24h后，與空白對(duì)照相比，顯著增加顆粒細(xì)胞基礎(chǔ)水平和FSH誘導(dǎo)的E2和P的分泌(P＜0.05);E2和P分泌相關(guān)基因CYP19、CYP11、StAR和3β-HSD的mRNA表達(dá)水平均顯著升高。之后，添加抑制素A(200ng/mL)處理

8、24h、48h和72h后，與空白對(duì)照相比，E2的分泌量顯著增加（P＜0.05），處理24h和48h后顯著增加P的分泌（P＜0.05），但72h后P的分泌與空白對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。抑制素A處理48h后，與空白對(duì)照相比，E2和P分泌相關(guān)基因CYP11、3β-HSD、StAR和CYP19水平均顯著升高;抑制素亞基(INHβA和INHβB)、活化素受體(ACVR2A)和繁殖相關(guān)基因(FSHR和FST)的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0