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文檔簡介
1、卵巢內卵泡的發(fā)育是卵巢內分泌及旁分泌影響下協(xié)調發(fā)展的過程,卵巢的顆粒細胞圍繞在卵母細胞周圍對隨后的卵泡發(fā)育、排卵、卵子受精及胚胎種植發(fā)揮重要的作用。在卵泡的生長發(fā)育過程中,一簇竇卵泡中僅選擇出一個主導卵泡,而大多數(shù)卵泡則發(fā)生閉鎖(凋亡)。顆粒細胞經過有絲分裂(增殖),隨后獲得促性腺激素受體具備生成甾體激素的能力(分化),排卵前卵泡的顆粒細胞對黃體的形成有重要的作用,而未排卵的卵泡的顆粒細胞則發(fā)生凋亡。卵泡閉鎖過程中顆粒細胞的凋亡發(fā)揮重要
2、的作用,不僅竇卵泡發(fā)生閉鎖,所有發(fā)育階段的卵泡均可發(fā)生閉鎖,顆粒細胞的普遍命運是凋亡。已有研究表明顆粒細胞的增殖凋亡狀態(tài)可影響卵泡的發(fā)育,卵母細胞的質量及后續(xù)的胚胎發(fā)育。迄今,參與調控顆粒細胞增殖凋亡的基因表達及分子機制尚不十分清楚,因此全面探討顆粒細胞增殖、凋亡及其相關基因的表達對進一步明確顆粒細胞功能狀態(tài)對于卵母細胞的命運、卵巢的功能的影響有重要意義。
卵巢顆粒細胞的增殖、分化、凋亡的機制及其調控非常復雜,牽涉到復雜的
3、分子作用機制和信號轉導通路。鉀離子通道是目前發(fā)現(xiàn)的亞型數(shù)目最多的一類細胞膜離子通道,在調控細胞動作電位的形成、膜復極化、維持靜息電位的水平以及在細胞的分泌和肌細胞的緊張等一系列細胞生理活動方面起著重要作用,是生物電活動的基礎,在細胞內和細胞間信號傳遞中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細胞存在電壓依賴的鉀離子通道,顆粒細胞電活動的調節(jié)為研究其細胞功能提供了一種新方法,顆粒細胞的去極化是卵母細胞成熟的重要特征,通過電耦相連的顆粒細胞和卵母細胞
4、之間的聯(lián)系可能代表了一種重要的信號傳導通路,但迄今為止,顆粒細胞功能與鉀離子通道信號通路之間的關系仍不清楚。
基于上述,本課題以此為切入點進行深入研究,第一、二部分首先通過檢測人卵巢黃素化顆粒細胞增殖、凋亡相關基因的表達情況,探討并明確顆粒細胞增殖、凋亡狀態(tài)及相關基因的表達在卵泡發(fā)育中的作用及對卵巢功能的影響,第三部分從鉀離子通道水平對顆粒細胞進行深入研究,探求顆粒細胞鉀離子通道被選擇性阻滯劑4-氨基吡啶(4-AP)阻滯后
5、,顆粒細胞的增殖、凋亡及孕激素分泌的改變及其可能的作用機制,以期為顆粒細胞功能調控與卵泡發(fā)育、閉鎖及卵母細胞成熟等生理、病理學問題提供一些理論基礎,對不孕癥的診斷和防治提供新思路。
第一部分:人卵巢黃素化顆粒細胞細胞周期蛋白D2的表達與卵巢功能的相關性研究
目的:通過檢測人卵巢黃素化顆粒細胞細胞周期蛋白D2(cyclin D2)及mRNA的表達,并以增殖細胞核抗原標記指數(shù)(PCNA-LI)作為顆粒細胞(GC)
6、增殖活性參數(shù),初步探索cyclin D2的表達在卵母細胞發(fā)育成熟進程中的作用及對妊娠結局的影響,探討顆粒細胞的增殖狀態(tài)對卵巢生殖功能的影響。
方法:收集32例行體外受精.胚胎移植(IVF-ET)患者的卵巢黃素化顆粒細胞,根據(jù)取卵時卵泡發(fā)育數(shù)不同將卵巢反應性分為為高反應組(卵泡直徑16mm以上的卵泡數(shù)≥20個)、中反應組(卵泡數(shù)5-19個)及低反應組(卵泡數(shù)≤4個)。采用免疫細胞化學方法檢測顆粒細胞膜上細胞cyclin D2
7、及PCNA蛋白的表達;逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測顆粒細胞cyclin D2 mRNA的表達水平;化學發(fā)光法測定基礎血清FSH,HCG日E2水平。分析顆粒細胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表達與IVF臨床參數(shù)(年齡、基礎FSH水平、促性腺激素的用量、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、卵巢反應性及妊娠結局)的關系以及和顆粒細胞增殖活性(PCNA標記指數(shù))的相關性。
結論:(1)體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細胞存在cyc
8、lin D2 mRNA及蛋白的表達。(2)黃素化顆粒細胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表達與年齡、基礎FSH呈負相關,與獲卵數(shù)及HCG日E2水平呈正相關,提示cyclin D2的表達可反映卵巢儲備功能。(3)黃素化顆粒細胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表達隨著卵巢反應性的增高而增強,提示cyclin D2的表達與卵巢反應性正相關。(4)黃素化顆粒細胞cyclin D2的表達與顆粒細胞的PCNA標記指數(shù)顯著正相關,進一步提示c
9、yclin D2的表達與卵巢顆粒細胞的增殖活性密切相關,cyclin D2可能通過調節(jié)顆粒細胞的增殖分化參與卵泡的發(fā)育。
第二部分:人黃素化卵巢顆粒細胞凋亡及其相關基因的表達與卵巢功能的相關性研究
目的:通過檢測人卵巢黃素化顆粒細胞的凋亡及其相關基因的表達,全面探討顆粒細胞凋亡對于卵巢功能及卵巢反應性的影響,進一步明確顆粒細胞凋亡對于卵母細胞的命運、卵巢的功能的內在調控機制。
方法:收集32例行
10、體外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞漿內單精子注射(ICSI)患者的卵巢黃素化顆粒細胞,根據(jù)取卵時卵泡發(fā)育數(shù)不同將卵巢反應性分為為高反應組(卵泡直徑16mm以上的卵泡數(shù)≥20個)、中反應組(卵泡數(shù)5-19個)及低反應組(卵泡數(shù)≤4個)。應用流式細胞儀AnnexinV-PI雙染法檢測顆粒細胞凋亡,同時利用新型熒光探針JC-1標記顆粒細胞線粒體,流式細胞儀測定細胞線粒體跨膜電位。采用免疫細胞化學方法檢測顆粒細胞膜上細胞survivin蛋
11、白的表達,逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測顆粒細胞survivin mRNA的表達水平。分光光度法檢測顆粒細胞內caspase-3活性?;瘜W發(fā)光法測定基礎血清FSH,HCG日E2水平。分析顆粒細胞的凋亡及其相關基因的表達與IVF臨床參數(shù)(年齡、基礎FSH水平、促性腺激素的用量、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、卵巢反應性及妊娠結局)的關系。
結論:(1)黃素化顆粒細胞的凋亡率可反映卵巢儲備功能與卵巢反應性,并與優(yōu)質胚胎率及妊
12、娠結局呈負相關,提示顆粒細胞的凋亡可能影響卵巢功能及胚胎的體外發(fā)育潛能。(2)黃素化顆粒細胞線粒體膜電位與優(yōu)質胚胎率、妊娠率呈正相關,其下降可反映顆粒細胞的凋亡,提示顆粒細胞的線粒體內膜完整性可能影響卵母細胞的質量及妊娠結局。(3)黃素化顆粒細胞存在survivin mRNA及蛋白的表達,其表達水平可反映卵巢儲備功能與卵巢反應性,并與優(yōu)質胚胎率呈顯著正相關,提示survivin的表達在顆粒細胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用,其可能通過降低ca
13、spase-3活性抑制顆粒細胞凋亡,從而影響卵巢的功能及胚胎的發(fā)育潛能。
第三部分:鉀離子通道阻滯劑對人卵巢黃素化顆粒細胞增殖、凋亡及孕酮分泌影響的研究
目的:探討鉀通道阻滯劑4-氨基比啶(4-AP)對人黃素化顆粒細胞增殖、凋亡及孕酮分泌的影響及其可能的機制。
方法:收集行體外受精-胚胎移植患者的卵巢黃素化顆粒細胞,分別加入不同濃度的4-AP(0、0、5、10mmol/L)進行體外培養(yǎng)24小時,
14、采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測不同濃度4-AP對顆粒細胞增殖的影響;應用流式細胞儀AnnexinV-PI雙染法檢測顆粒細胞凋亡;同時利用新型熒光探針JC-1標記顆粒細胞線粒體,流式細胞儀測定細胞線粒體跨膜電位的變化;化學發(fā)光法測定4-AP對于基礎狀態(tài)(HCG=0IU/L)及HCG誘導狀態(tài)下(HCG=1250IU/L)孕酮分泌的影響;采用放射免疫測定法(RLA)檢測細胞內cAMP濃度。應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白印
15、記技術(Western blotting)檢測顆粒細胞內增殖、凋亡及激素生成相關基因(cyclinD2,PCNA,Survivin.StAR)的mRNA和蛋白表達情況。
結論:(1)4-AP以時間劑量依賴的方式抑制人黃素化顆粒細胞的增殖,4-AP可能是通過降低cyclinD2和PCNA的表達,使細胞周期進展阻滯,從而抑制顆粒細胞的增殖。(2)4-AP可誘導人黃素化顆粒細胞的凋亡,4-AP作用后顆粒細胞凋亡率增高,線粒體膜電
16、位下降,細胞內caspase-3的活性較基礎狀態(tài)明顯增高,同時survivin表達下降。(3)4-AP抑制人卵巢顆粒細胞孕酮的分泌,可能與cAMP產生減少和StAR表達降低有關。
綜上所述,研究發(fā)現(xiàn):(1)體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細胞cyclin D2的表達與卵巢的功能及促排卵過程中卵巢的反應性有關。cyclin D2的表達代表了卵巢顆粒細胞的增殖活性,cyclin D2可能通過調節(jié)顆粒細胞的增殖分化參與卵泡的發(fā)育。(2
17、)黃素化顆粒細胞的凋亡及線粒體內膜的完整性可能影響卵巢功能及胚胎的體外發(fā)育潛能;凋亡相關基因Survivin可能在顆粒細胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用,其可能通過降低caspase-3活性抑制顆粒細胞凋亡,從而影響卵巢的功能及胚胎的發(fā)育。(3)鉀離子通道阻滯劑4-AP以時間劑量依賴的方式抑制人黃素化顆粒細胞的增殖及孕激素的分泌,同時誘導其凋亡,提示鉀離子通道作為一種新的信號轉導通道可能在卵巢顆粒細胞增殖、凋亡及孕激素分泌過程中發(fā)揮一定作用。
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