鉀離子通道阻滯劑對人卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及孕酮分泌的影響及機制研究.pdf

1、卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育是卵巢內(nèi)分泌及旁分泌影響下協(xié)調(diào)發(fā)展的過程，卵巢的顆粒細(xì)胞圍繞在卵母細(xì)胞周圍對隨后的卵泡發(fā)育、排卵、卵子受精及胚胎種植發(fā)揮重要的作用。在卵泡的生長發(fā)育過程中，一簇竇卵泡中僅選擇出一個主導(dǎo)卵泡，而大多數(shù)卵泡則發(fā)生閉鎖（凋亡）。顆粒細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂（增殖），隨后獲得促性腺激素受體具備生成甾體激素的能力（分化），排卵前卵泡的顆粒細(xì)胞對黃體的形成有重要的作用，而未排卵的卵泡的顆粒細(xì)胞則發(fā)生凋亡。卵泡閉鎖過程中顆粒細(xì)胞的凋亡發(fā)揮重要

2、的作用，不僅竇卵泡發(fā)生閉鎖，所有發(fā)育階段的卵泡均可發(fā)生閉鎖，顆粒細(xì)胞的普遍命運是凋亡。已有研究表明顆粒細(xì)胞的增殖凋亡狀態(tài)可影響卵泡的發(fā)育，卵母細(xì)胞的質(zhì)量及后續(xù)的胚胎發(fā)育。迄今，參與調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖凋亡的基因表達(dá)及分子機制尚不十分清楚，因此全面探討顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)對進一步明確顆粒細(xì)胞功能狀態(tài)對于卵母細(xì)胞的命運、卵巢的功能的影響有重要意義。
　　 卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、分化、凋亡的機制及其調(diào)控非常復(fù)雜，牽涉到復(fù)雜的

3、分子作用機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。鉀離子通道是目前發(fā)現(xiàn)的亞型數(shù)目最多的一類細(xì)胞膜離子通道，在調(diào)控細(xì)胞動作電位的形成、膜復(fù)極化、維持靜息電位的水平以及在細(xì)胞的分泌和肌細(xì)胞的緊張等一系列細(xì)胞生理活動方面起著重要作用，是生物電活動的基礎(chǔ)，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號傳遞中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞存在電壓依賴的鉀離子通道，顆粒細(xì)胞電活動的調(diào)節(jié)為研究其細(xì)胞功能提供了一種新方法，顆粒細(xì)胞的去極化是卵母細(xì)胞成熟的重要特征，通過電耦相連的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞

4、之間的聯(lián)系可能代表了一種重要的信號傳導(dǎo)通路，但迄今為止，顆粒細(xì)胞功能與鉀離子通道信號通路之間的關(guān)系仍不清楚。
　　 基于上述，本課題以此為切入點進行深入研究，第一、二部分首先通過檢測人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，探討并明確顆粒細(xì)胞增殖、凋亡狀態(tài)及相關(guān)基因的表達(dá)在卵泡發(fā)育中的作用及對卵巢功能的影響，第三部分從鉀離子通道水平對顆粒細(xì)胞進行深入研究，探求顆粒細(xì)胞鉀離子通道被選擇性阻滯劑4-氨基吡啶（4-AP）阻滯后

5、，顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡及孕激素分泌的改變及其可能的作用機制，以期為顆粒細(xì)胞功能調(diào)控與卵泡發(fā)育、閉鎖及卵母細(xì)胞成熟等生理、病理學(xué)問題提供一些理論基礎(chǔ)，對不孕癥的診斷和防治提供新思路。
　　 第一部分：人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D2的表達(dá)與卵巢功能的相關(guān)性研究
　　 目的：通過檢測人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D2（cyclin D2）及mRNA的表達(dá)，并以增殖細(xì)胞核抗原標(biāo)記指數(shù)（PCNA-LI）作為顆粒細(xì)胞（GC）

6、增殖活性參數(shù)，初步探索cyclin D2的表達(dá)在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟進程中的作用及對妊娠結(jié)局的影響，探討顆粒細(xì)胞的增殖狀態(tài)對卵巢生殖功能的影響。
　　 方法：收集32例行體外受精.胚胎移植（IVF-ET）患者的卵巢黃素化顆粒細(xì)胞，根據(jù)取卵時卵泡發(fā)育數(shù)不同將卵巢反應(yīng)性分為為高反應(yīng)組（卵泡直徑16mm以上的卵泡數(shù)≥20個）、中反應(yīng)組（卵泡數(shù)5-19個）及低反應(yīng)組（卵泡數(shù)≤4個）。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測顆粒細(xì)胞膜上細(xì)胞cyclin D2

7、及PCNA蛋白的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測顆粒細(xì)胞cyclin D2 mRNA的表達(dá)水平；化學(xué)發(fā)光法測定基礎(chǔ)血清FSH，HCG日E2水平。分析顆粒細(xì)胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表達(dá)與IVF臨床參數(shù)（年齡、基礎(chǔ)FSH水平、促性腺激素的用量、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、卵巢反應(yīng)性及妊娠結(jié)局）的關(guān)系以及和顆粒細(xì)胞增殖活性（PCNA標(biāo)記指數(shù)）的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：（1）體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞存在cyc

8、lin D2 mRNA及蛋白的表達(dá)。（2）黃素化顆粒細(xì)胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表達(dá)與年齡、基礎(chǔ)FSH呈負(fù)相關(guān)，與獲卵數(shù)及HCG日E2水平呈正相關(guān)，提示cyclin D2的表達(dá)可反映卵巢儲備功能。（3）黃素化顆粒細(xì)胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表達(dá)隨著卵巢反應(yīng)性的增高而增強，提示cyclin D2的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性正相關(guān)。（4）黃素化顆粒細(xì)胞cyclin D2的表達(dá)與顆粒細(xì)胞的PCNA標(biāo)記指數(shù)顯著正相關(guān)，進一步提示c

9、yclin D2的表達(dá)與卵巢顆粒細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)，cyclin D2可能通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖分化參與卵泡的發(fā)育。
　　 第二部分：人黃素化卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)與卵巢功能的相關(guān)性研究
　　 目的：通過檢測人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)，全面探討顆粒細(xì)胞凋亡對于卵巢功能及卵巢反應(yīng)性的影響，進一步明確顆粒細(xì)胞凋亡對于卵母細(xì)胞的命運、卵巢的功能的內(nèi)在調(diào)控機制。
　　 方法：收集32例行

10、體外受精-胚胎移植（IVF-ET）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）患者的卵巢黃素化顆粒細(xì)胞，根據(jù)取卵時卵泡發(fā)育數(shù)不同將卵巢反應(yīng)性分為為高反應(yīng)組（卵泡直徑16mm以上的卵泡數(shù)≥20個）、中反應(yīng)組（卵泡數(shù)5-19個）及低反應(yīng)組（卵泡數(shù)≤4個）。應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI雙染法檢測顆粒細(xì)胞凋亡，同時利用新型熒光探針JC-1標(biāo)記顆粒細(xì)胞線粒體，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞線粒體跨膜電位。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測顆粒細(xì)胞膜上細(xì)胞survivin蛋

11、白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測顆粒細(xì)胞survivin mRNA的表達(dá)水平。分光光度法檢測顆粒細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性。化學(xué)發(fā)光法測定基礎(chǔ)血清FSH，HCG日E2水平。分析顆粒細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)與IVF臨床參數(shù)（年齡、基礎(chǔ)FSH水平、促性腺激素的用量、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、卵巢反應(yīng)性及妊娠結(jié)局）的關(guān)系。
　　 結(jié)論：（1）黃素化顆粒細(xì)胞的凋亡率可反映卵巢儲備功能與卵巢反應(yīng)性，并與優(yōu)質(zhì)胚胎率及妊

12、娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，提示顆粒細(xì)胞的凋亡可能影響卵巢功能及胚胎的體外發(fā)育潛能。（2）黃素化顆粒細(xì)胞線粒體膜電位與優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率呈正相關(guān)，其下降可反映顆粒細(xì)胞的凋亡，提示顆粒細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜完整性可能影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量及妊娠結(jié)局。（3）黃素化顆粒細(xì)胞存在survivin mRNA及蛋白的表達(dá)，其表達(dá)水平可反映卵巢儲備功能與卵巢反應(yīng)性，并與優(yōu)質(zhì)胚胎率呈顯著正相關(guān)，提示survivin的表達(dá)在顆粒細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用，其可能通過降低ca

13、spase-3活性抑制顆粒細(xì)胞凋亡，從而影響卵巢的功能及胚胎的發(fā)育潛能。
　　 第三部分：鉀離子通道阻滯劑對人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及孕酮分泌影響的研究
　　 目的：探討鉀通道阻滯劑4-氨基比啶（4-AP）對人黃素化顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及孕酮分泌的影響及其可能的機制。
　　 方法：收集行體外受精-胚胎移植患者的卵巢黃素化顆粒細(xì)胞，分別加入不同濃度的4-AP（0、0、5、10mmol/L）進行體外培養(yǎng)24小時，

14、采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測不同濃度4-AP對顆粒細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI雙染法檢測顆粒細(xì)胞凋亡；同時利用新型熒光探針JC-1標(biāo)記顆粒細(xì)胞線粒體，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化；化學(xué)發(fā)光法測定4-AP對于基礎(chǔ)狀態(tài)（HCG=0IU/L）及HCG誘導(dǎo)狀態(tài)下（HCG=1250IU/L）孕酮分泌的影響；采用放射免疫測定法（RLA）檢測細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白印

15、記技術(shù)（Western blotting）檢測顆粒細(xì)胞內(nèi)增殖、凋亡及激素生成相關(guān)基因（cyclinD2，PCNA，Survivin.StAR）的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)論：（1）4-AP以時間劑量依賴的方式抑制人黃素化顆粒細(xì)胞的增殖，4-AP可能是通過降低cyclinD2和PCNA的表達(dá)，使細(xì)胞周期進展阻滯，從而抑制顆粒細(xì)胞的增殖。（2）4-AP可誘導(dǎo)人黃素化顆粒細(xì)胞的凋亡，4-AP作用后顆粒細(xì)胞凋亡率增高，線粒體膜電

16、位下降，細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性較基礎(chǔ)狀態(tài)明顯增高，同時survivin表達(dá)下降。（3）4-AP抑制人卵巢顆粒細(xì)胞孕酮的分泌，可能與cAMP產(chǎn)生減少和StAR表達(dá)降低有關(guān)。
　　 綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)：（1）體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞cyclin D2的表達(dá)與卵巢的功能及促排卵過程中卵巢的反應(yīng)性有關(guān)。cyclin D2的表達(dá)代表了卵巢顆粒細(xì)胞的增殖活性，cyclin D2可能通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖分化參與卵泡的發(fā)育。（2

17、）黃素化顆粒細(xì)胞的凋亡及線粒體內(nèi)膜的完整性可能影響卵巢功能及胚胎的體外發(fā)育潛能；凋亡相關(guān)基因Survivin可能在顆粒細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用，其可能通過降低caspase-3活性抑制顆粒細(xì)胞凋亡，從而影響卵巢的功能及胚胎的發(fā)育。（3）鉀離子通道阻滯劑4-AP以時間劑量依賴的方式抑制人黃素化顆粒細(xì)胞的增殖及孕激素的分泌，同時誘導(dǎo)其凋亡，提示鉀離子通道作為一種新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道可能在卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及孕激素分泌過程中發(fā)揮一定作用。