AQP9基因在水牛卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一類(lèi)位于原核和真核生物細(xì)胞膜上、與水的運(yùn)輸密切相關(guān)的特異膜通道蛋白。對(duì)小鼠及人的研究發(fā)現(xiàn)，除水轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，部分AQPs參與卵泡形成和發(fā)育，與顆粒細(xì)胞的凋亡、卵泡閉鎖及雌性動(dòng)物生育力密切相關(guān)，但對(duì)其作用機(jī)理尚不完全清晰。本研究克隆了水牛AQP9基因的編碼區(qū)序列，分析其在水牛卵泡和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，以及不同閉鎖程度卵泡顆粒細(xì)胞和體外成熟卵母細(xì)胞周?chē)亚鸺?xì)胞中的AQP9與凋亡相關(guān)基因的

2、表達(dá)水平;其次，通過(guò)過(guò)表達(dá)AQP9基因及添加PKC抑制劑Staurosporine的方式探索了AQP9基因表達(dá)與水牛顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以及AQP9基因在PKC信號(hào)通路調(diào)控的顆粒細(xì)胞凋亡中的作用。研究可為深入了解水牛卵泡閉鎖發(fā)生機(jī)制、提高水牛繁殖性能奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　首先，應(yīng)用RT-PCR方法克隆得到水牛AQP9基因888 bp的編碼區(qū)序列，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其編碼295個(gè)氨基酸。多重序列比較顯示，水牛AQP9基因與牛

3、、豬、綿羊和人相應(yīng)序列相似性分別為99％、90％、97％、88％;氨基酸序列同源性分別為99％、86％、97％、83％，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，AQP9基因在物種進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，水牛AQP9蛋白含有17個(gè)蘇氨酸(Thr)，不含有信號(hào)肽，存在潛在的磷酸化位點(diǎn)和水通道蛋白特有的結(jié)構(gòu)域Pfam MIP。
　　其次，對(duì)AQP9基因在水牛雌性生殖細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律研究發(fā)現(xiàn):AQP9蛋白在水牛原始、初級(jí)、次級(jí)和有腔

4、卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，與GV期相比，AQP9基因在體外成熟的MⅡ期卵母細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高(p＜0.05)，在2-細(xì)胞、4-細(xì)胞胚胎及桑椹胚中未檢測(cè)到其表達(dá)，囊胚期有表達(dá)。在不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細(xì)胞中，隨著卵泡閉鎖程度加深，AQP9及凋亡相關(guān)基因Bax、caspase3和Fas的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，其中AQP9基因的表達(dá)在早期閉鎖卵泡中顯著升高(p＜0.05)。在不同體外成熟質(zhì)量卵母細(xì)胞周?chē)亚鸺?xì)胞中的

5、表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與成熟質(zhì)量好的卵母細(xì)胞卵丘細(xì)胞相比，AQP9基因在成熟質(zhì)量差的卵丘細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高(p＜0.01);同時(shí)凋亡相關(guān)基因Bax、caspase3和Fas的表達(dá)也顯著升高(p＜0.05)。
　　最后，在探討水牛顆粒細(xì)胞凋亡與AQP9表達(dá)關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn):過(guò)表AQP9基因的水牛顆粒細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)可顯著上AQP9及凋亡相關(guān)基因Bax、caspase3、Fas的表達(dá)，顯著下調(diào)Bc1-2的表達(dá)(p＜0.05)。在分析PKC抑制

6、劑Staurosporine介導(dǎo)的水牛顆粒細(xì)胞凋亡與AQP9基因表達(dá)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Staurosporine處理的水牛顆粒細(xì)胞，其形態(tài)出現(xiàn)塌陷，細(xì)胞膜出現(xiàn)拉絲樣向周?chē)稚ⅲ|(zhì)空泡增多，懸浮死亡細(xì)胞增多，流式分析結(jié)果顯示，Staurosporine以濃度依賴(lài)型促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，且隨著顆粒細(xì)胞凋亡程度的加深，AQP9及凋亡相關(guān)基因caspase3、Bax和p53的表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.05)，AQP9和Bax蛋白的表達(dá)亦隨著細(xì)胞凋亡程