AQP9基因在水牛卵泡顆粒細胞中的表達及其與細胞凋亡的初步研究.pdf

1、水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一類位于原核和真核生物細胞膜上、與水的運輸密切相關的特異膜通道蛋白。對小鼠及人的研究發(fā)現(xiàn)，除水轉(zhuǎn)運功能外，部分AQPs參與卵泡形成和發(fā)育，與顆粒細胞的凋亡、卵泡閉鎖及雌性動物生育力密切相關，但對其作用機理尚不完全清晰。本研究克隆了水牛AQP9基因的編碼區(qū)序列，分析其在水牛卵泡和早期胚胎發(fā)育過程中的表達規(guī)律，以及不同閉鎖程度卵泡顆粒細胞和體外成熟卵母細胞周圍卵丘細胞中的AQP9與凋亡相關基因的

2、表達水平;其次，通過過表達AQP9基因及添加PKC抑制劑Staurosporine的方式探索了AQP9基因表達與水牛顆粒細胞凋亡的關系，以及AQP9基因在PKC信號通路調(diào)控的顆粒細胞凋亡中的作用。研究可為深入了解水牛卵泡閉鎖發(fā)生機制、提高水牛繁殖性能奠定基礎。主要研究結(jié)果如下:
　　首先，應用RT-PCR方法克隆得到水牛AQP9基因888 bp的編碼區(qū)序列，生物信息學預測其編碼295個氨基酸。多重序列比較顯示，水牛AQP9基因與牛

3、、豬、綿羊和人相應序列相似性分別為99％、90％、97％、88％;氨基酸序列同源性分別為99％、86％、97％、83％，系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，AQP9基因在物種進化過程中具有高度保守性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，水牛AQP9蛋白含有17個蘇氨酸(Thr)，不含有信號肽，存在潛在的磷酸化位點和水通道蛋白特有的結(jié)構(gòu)域Pfam MIP。
　　其次，對AQP9基因在水牛雌性生殖細胞中的表達規(guī)律研究發(fā)現(xiàn):AQP9蛋白在水牛原始、初級、次級和有腔

4、卵泡顆粒細胞中均有表達。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，與GV期相比，AQP9基因在體外成熟的MⅡ期卵母細胞中的表達水平顯著升高(p＜0.05)，在2-細胞、4-細胞胚胎及桑椹胚中未檢測到其表達，囊胚期有表達。在不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細胞中，隨著卵泡閉鎖程度加深，AQP9及凋亡相關基因Bax、caspase3和Fas的表達呈上升趨勢，其中AQP9基因的表達在早期閉鎖卵泡中顯著升高(p＜0.05)。在不同體外成熟質(zhì)量卵母細胞周圍卵丘細胞中的

5、表達分析發(fā)現(xiàn)，與成熟質(zhì)量好的卵母細胞卵丘細胞相比，AQP9基因在成熟質(zhì)量差的卵丘細胞中的表達顯著升高(p＜0.01);同時凋亡相關基因Bax、caspase3和Fas的表達也顯著升高(p＜0.05)。
　　最后，在探討水牛顆粒細胞凋亡與AQP9表達關系的研究發(fā)現(xiàn):過表AQP9基因的水牛顆粒細胞經(jīng)無血清培養(yǎng)可顯著上AQP9及凋亡相關基因Bax、caspase3、Fas的表達，顯著下調(diào)Bc1-2的表達(p＜0.05)。在分析PKC抑制

6、劑Staurosporine介導的水牛顆粒細胞凋亡與AQP9基因表達關系的實驗中發(fā)現(xiàn)，Staurosporine處理的水牛顆粒細胞，其形態(tài)出現(xiàn)塌陷，細胞膜出現(xiàn)拉絲樣向周圍分散，胞質(zhì)空泡增多，懸浮死亡細胞增多，流式分析結(jié)果顯示，Staurosporine以濃度依賴型促進顆粒細胞凋亡，且隨著顆粒細胞凋亡程度的加深，AQP9及凋亡相關基因caspase3、Bax和p53的表達顯著上調(diào)(p＜0.05)，AQP9和Bax蛋白的表達亦隨著細胞凋亡程