時鐘基因在母雞生殖系統(tǒng)中的節(jié)律性表達及顆粒細胞中時控基因的篩選.pdf

1、晝夜節(jié)律幾乎影響了生物體生命活動的方方面面，幫助其趨利避害，實現(xiàn)和外界環(huán)境的同步和適應(yīng)，是生命的基本特征之一。雌禽的排卵-產(chǎn)蛋循環(huán)便具有明顯的節(jié)律性和環(huán)境適應(yīng)性，具體表現(xiàn)在排卵（產(chǎn)蛋）時間偏好、連產(chǎn)間歇等方面。時間生物學(xué)和生殖內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)展為解釋上述現(xiàn)象提供了理論基礎(chǔ)，但性腺軸上的調(diào)控復(fù)雜交錯，卵泡的成熟，排卵和蛋的形成是多組織、多過程、多層次參與的生理事件，其間不同生理進程在時間上的吻合顯示了機體自身的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。
　　單獨研究神

2、經(jīng)內(nèi)分泌或卵泡的發(fā)育無法全面的解釋排卵-產(chǎn)蛋這一復(fù)雜又特殊的生理過程，本研究從晝夜生物鐘系統(tǒng)切入，整合各過程的時間控制因素，解析排卵-產(chǎn)蛋中的節(jié)律現(xiàn)象。
　　1.產(chǎn)蛋監(jiān)測與產(chǎn)蛋規(guī)律分析
　　本研究通過記錄母雞在特定時間段里的具體產(chǎn)蛋時間，得到了商品蛋雞羅曼粉殼蛋雞在常規(guī)飼養(yǎng)條件下的產(chǎn)蛋性狀，包括:產(chǎn)蛋時間分布、連產(chǎn)間歇、間歇前一天產(chǎn)蛋時間分布和產(chǎn)蛋間隔時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn):母雞產(chǎn)蛋有極強的時間偏好性，主要集中在8:00-12:00

3、這個時段;產(chǎn)蛋性能好的母雞產(chǎn)蛋時間間隔以24小時為軸心左右波動。連產(chǎn)間歇前一天的產(chǎn)蛋時間在早、晚兩個時段密集分布，說明接近開放期的前后邊緣都會造成產(chǎn)蛋間歇。證實了產(chǎn)蛋開放期模型。
　　通過產(chǎn)蛋規(guī)律的監(jiān)測，挑選出了生理狀態(tài)一致（產(chǎn)蛋時間和產(chǎn)蛋周期一致）的雞群作為后續(xù)的試驗材料。
　　2.時鐘基因的節(jié)律性表達與發(fā)條機制的定位
　　本研究通過檢測時鐘基因(Bmal1，Bmal2，Cloc，Per2，Per3，Cry1，Cry

4、2)在等級卵泡的顆粒細胞和膜細胞以及輸卵管的四個部位中的表達情況，運用余弦分析法檢測其表達是否呈現(xiàn)顯著性節(jié)律震蕩，結(jié)合生物鐘運行的分子機制，將時鐘基因在一個晝夜周期內(nèi)的表達規(guī)律加以組合，根據(jù)峰值時間關(guān)系確定生物鐘發(fā)條機制在該組織中是否存在。
　　結(jié)果表明:生物鐘發(fā)條機制在F1-F3卵泡的顆粒細胞以及輸卵管的傘部和子宮部中存在，并且確定了在其他檢測組織中（如膜細胞）不存在運行的生物鐘發(fā)條機制。比較顆粒細胞中生物鐘節(jié)律的強度和時相狀態(tài)

5、（標(biāo)志性時鐘基因的峰值時間）發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1中節(jié)律震蕩最強，F(xiàn)2次之，F(xiàn)3最小，但它們之間的時相狀態(tài)沒有明顯區(qū)別。輸卵管的子宮部時相狀態(tài)要顯著早于傘部。
　　3.促黃體素對時鐘基因表達的調(diào)控及機理研究
　　本研究通過添加特異性的信號通路阻斷劑，從時鐘基因的表達變化來探索促黃體素(Luteinizing hormone，LH)對時鐘基因調(diào)控的分子機理。體外培養(yǎng)的F1顆粒細胞施加地塞米松同步化處理作為對照組，試驗組添加LH處理。結(jié)果發(fā)

6、現(xiàn)，24小時周期內(nèi)，對照組和試驗組中時鐘基因表達趨勢都較平緩，余弦分析節(jié)律性時均未達到顯著水平。施加LH處理4個小時后(Zeitgeber Time4，ZT4)，Bmal1的表達量顯著增高;Per2在ZT4和ZT8兩個時間點試驗組均顯著的高于對照組;Clock在LH處理后表達不再有任何波動變化;Cry1在ZT12，ZT20，ZT24三個時間點表達量都是試驗組顯著的高于對照組。添加cAMP抑制劑(H89)可以阻斷LH對時鐘基因Bmal1和

7、Per2的促進作用，證明了LH對時鐘基因的調(diào)控依賴于cAMP/PKA信號通路。單獨抑制Erk1/2和p38MAPK信號通路對Bmal1的阻斷作用不顯著，但都顯著的阻斷了對Per2的促進作用，當(dāng)同時抑制Erk1/2和p38MAPK時，Bmal1和Per2的表達均接近對照組，顯著的低于LH處理組，證明了Erk1/2和p38MAPK兩條通路協(xié)同作用傳導(dǎo)LH帶來的胞外信號。
　　4.全面篩選F1卵泡顆粒細胞中的時控基因
　　本研究采

8、用高通量測序技術(shù)檢測了F1卵泡中顆粒細胞在一個完整晝夜周期內(nèi)的表達譜，通過“JTK_CYCLE”算法篩選時控基因（受生物鐘發(fā)條機制調(diào)控的基因），全景式的描述卵泡顆粒細胞生物鐘參與的生理過程和調(diào)控通路。結(jié)果表明:365個基因具有晝夜節(jié)律性表達，調(diào)控和參與了眾多的生理功能和生物學(xué)過程，主要富集在核糖體蛋白和剪切蛋白通路。核糖體蛋白和腫瘤發(fā)生有密切的關(guān)系，因此母雞卵泡可作為研究卵巢癌的模型;剪切蛋白負責(zé)的剪切作用是一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾，表明發(fā)