豬Gpr3基因特征、表達(dá)及其對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的影響.pdf

1、哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，主要包括:原始卵泡的募集、腔前卵泡的發(fā)育、有腔卵泡的選擇和生長(zhǎng)及卵泡的成熟或閉鎖。該過(guò)程受激素、生長(zhǎng)因子、金屬離子等多種因素控制，最終只有少數(shù)卵泡發(fā)育為優(yōu)勢(shì)卵泡并排卵，99％以上的卵泡發(fā)生閉鎖。卵泡顆粒細(xì)胞是卵泡中最重要的體細(xì)胞，它對(duì)卵母細(xì)胞成熟、卵泡發(fā)育有至關(guān)重要的作用。伴隨著哺乳動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育，顆粒細(xì)胞體積增大、數(shù)量增多并逐步分化和成熟。G蛋白偶聯(lián)受體3（G protein-couple

2、d receptor3，Gpr3）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。近年來(lái)的研究表明，Gpr3在小鼠和人的卵巢中通過(guò)Gs蛋白介導(dǎo)的下游通路調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟。但Gpr3在豬卵巢中的表達(dá)規(guī)律及在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，深入研究豬Gpr3在卵巢及卵泡發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，探索Gpr3信號(hào)通路在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用及其調(diào)控機(jī)制，可以為哺乳動(dòng)物繁殖性狀的選育提供可能的理論基礎(chǔ)，在提高家畜繁殖性能方面具有重要意義。<

3、br>　　 本論文以三元商品豬為研究對(duì)象，采用電子克隆與傳統(tǒng)克隆相結(jié)合的方法，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了豬Gpr3基因的全長(zhǎng)序列和舍有完整編碼框的Gpr6及Gpr12的部分cDNA序列，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究;利用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time) PCR和免疫蛋白印跡（Western blotting）技術(shù)對(duì)Gpr3在組織及卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析;利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)豬胎

4、兒期50、70和90（日齡）、新生1日齡及生后期25、35、70、140和180（日齡）9個(gè)階段豬卵巢組織中Gpr3蛋白的表達(dá)進(jìn)行了細(xì)胞定位;利用real-time PCR和Western blotting技術(shù)對(duì)不同日齡、不同品種卵巢及不同直徑卵泡中Gpr3的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析;利用構(gòu)建的Gpr3真核表達(dá)載體及與GFP融合表達(dá)載體檢測(cè)了Gpr3在人胚腎（HEK293）細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位、組成性活性以及鞘脂類脂質(zhì)對(duì)Gpr3組成性活性和受體

5、內(nèi)化作用的影響;采用RNAi技術(shù)敲減Gpr3，阻抑Gpr3介導(dǎo)的信號(hào)通路，利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、放射免疫測(cè)定（Radioimmunoassay, RIA）、real-time PCR等方法檢測(cè)阻抑該信號(hào)通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制;采用超表達(dá)Gpr3的方式激活其介導(dǎo)的信號(hào)通路，利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、RLA、real-time PCR等方法檢測(cè)超表達(dá)Gpr3后對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的影響，主要研究結(jié)果如下:
　　

6、 1用電子克隆和RACE的方法克隆了豬Gpr3基因的全長(zhǎng)序列和含有完整編碼框的Gpr6及Gpr12的部分cDNA序列，GenBank登錄號(hào)分別為HQ606483、HM777010和HM77711，并做生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明:豬Gpr3基因的cDNA由2101個(gè)核苷酸組成，編碼330個(gè)氨基酸，分子量為35.2 kDa，位于第6號(hào)染色體，與牛、犬、人、黑猩猩、小鼠和大鼠的氨基酸相似性分別為96.4％，95.1％，94.9％，94.8％

7、，90.0％和85.4％。它具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域，存在多個(gè)潛在的磷酸化和糖基化修飾位點(diǎn)，表明它是一個(gè)功能活躍的跨膜蛋白，可能參與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控等過(guò)程。另外，豬Gpr3、Gpr6和Gpr12的蛋白序列比對(duì)及功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，它們彼此間具有高度的序列同源性和相似的潛在功能，將三者歸為同一受體亞家族，稱為Gpr3亞家族。
　　 2用real-time PCR和Western blotting的方法檢測(cè)豬Gpr3基因的組織分

8、布及在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的表達(dá)模式，結(jié)果表明:豬Gpr3基因在大腦、小腦、下丘腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪、胸腺、卵巢、輸卵管、子宮、睪丸、卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，但僅在腦、垂體、肝臟、脂肪、子宮和卵母細(xì)胞中大量表達(dá)，推測(cè)其在豬的神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能維持方面具有重要作用，可能參與豬的脂肪代謝。另外，Gpr3基因在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，并且與卵丘擴(kuò)散程度呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.9

9、37，P＜0.01)，表明其可能對(duì)卵丘擴(kuò)散和卵母細(xì)胞成熟具有重要作用。成熟促進(jìn)因子（Maturation promotingfactor，MPF）的調(diào)節(jié)亞基Cyclin B1基因在卵母細(xì)胞體外成熟前期的表達(dá)量較低(0-24h)，后期顯著的升高(24-44 h)，而催化亞基CDK1基因的表達(dá)水平在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中保持相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明MPF可能主要在卵母細(xì)胞體外成熟后期發(fā)揮作用。
　　 3用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Gpr3蛋白在9個(gè)階段豬卵

10、巢組織中的表達(dá)與定位，結(jié)果表明:在胎兒和新生期，Gpr3主要在卵母細(xì)胞巢中的卵原細(xì)胞、原始卵泡和初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中表達(dá);在生后期，Gpr3在腔前卵泡和有腔卵泡的顆粒細(xì)胞層、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，并且在卵母細(xì)胞中的表達(dá)量最高。另外，在成年豬卵巢的黃體中也有微弱的表達(dá)。Real-time PCR和Western blotting結(jié)果表明，Gpr3mRNA和蛋白在不同發(fā)育階段豬卵巢中均有表達(dá)，表達(dá)量呈波浪狀變化，在新生及出生后140

11、日齡的表達(dá)量最高;在不同品種豬的卵巢中，Gpr3的表達(dá)量趨于一致，未見(jiàn)顯著性差異;在不同直徑豬卵巢卵泡中，Gpr3的表達(dá)量隨著卵泡直徑的增加而上升。豬Gpr3受體在卵巢中的細(xì)胞和時(shí)期特異性表達(dá)模式表明，其可能在豬卵泡發(fā)育和黃體形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 4為了探究Gpr3的性質(zhì)功能并篩選其潛在的配體，我們構(gòu)建了Gpr3真核表達(dá)載體及與GFP融合表達(dá)載體，用以檢測(cè)Gpr3在人胚腎（HEK293）細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位、組成性活性、

12、鞘脂類脂質(zhì)對(duì)組成性活性和受體內(nèi)化的影響。結(jié)果表明:在HEK293細(xì)胞中，Gpr3的表達(dá)引起了腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)組成性激活，并且激活程度與完全激活Gs偶聯(lián)受體的程度相似。而且，鞘氨醇1-磷酸(sphingosine1-phosphate，S1P)可以通過(guò)組成性激活的Gpr3受體進(jìn)一步增加AC的活性。當(dāng)在HEK239細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）標(biāo)

13、記的Gpr3受體時(shí)發(fā)現(xiàn)，綠色熒光僅集中于細(xì)胞膜和亞細(xì)胞膜中。S1P處理后，通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡可以觀察到激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體內(nèi)化過(guò)程。而鞘氨醇（sphingosine，Sph）和鞘磷脂（sphingomyelin, Sphi）不具備以上功能。說(shuō)明，Gpr3是組成性激活的G蛋白偶聯(lián)受體，它的組成性活性及激動(dòng)劑誘導(dǎo)的內(nèi)化作用受到脂質(zhì)調(diào)節(jié)者S1P的調(diào)控，表明S1P可能是豬Gpr3受體的潛在激動(dòng)劑。
　　 5為了研究Gpr3信號(hào)通路在豬卵泡

14、顆粒細(xì)胞中的作用，本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細(xì)胞(pGCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用RNAi技術(shù)“沉默”Gpr3阻抑其介導(dǎo)的信號(hào)通路，以檢測(cè)Gpr3受體在豬卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)及分化過(guò)程中的作用。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染Gpr3特異性的siRNA后，能夠有效地抑制顆粒細(xì)胞中Gpr3 mRNA和蛋白的表達(dá)，成功地阻抑了Gpr3介導(dǎo)的信號(hào)通路。MTT、流式細(xì)胞術(shù)及RLA檢測(cè)的結(jié)果表明，阻抑Gpr3信號(hào)通路能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制顆粒細(xì)胞凋亡，

15、但對(duì)顆粒細(xì)胞中類固醇激素的合成沒(méi)有影響。另外，阻抑Gpr3信號(hào)通路顯著改變了Cyclin B1、CyclinD2、Bcl-2、Bax和Gpr12的表達(dá)(P＜0.05），而對(duì)CDK1、CDK、P450arom、P450scc和Gpr6的表達(dá)沒(méi)有影響(P＞0.05)。
　　 6為了進(jìn)一步明確Gpr3在豬顆粒細(xì)胞中的功能，我們?cè)陬w粒細(xì)胞中超表達(dá)了Gpr3受體，結(jié)果表明:超表達(dá)Gpr3能顯著抑制顆粒細(xì)胞的增殖，增加G0/G1期細(xì)胞的百分

16、含量，減少S期的細(xì)胞，同時(shí)降低細(xì)胞周期標(biāo)志蛋白Cyclin B1和CDK1的mRNA表達(dá);超表達(dá)Gpr3能顯著增加顆粒細(xì)胞的凋亡比率，抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá);超表達(dá)Gpr3促進(jìn)了Gpr6的表達(dá);然而，超表達(dá)Gpr3不影響雌二醇和孕酮的分泌，并且未顯著改變P450arom和P450scc的表達(dá)。由此可見(jiàn)，Gpr3信號(hào)通路在調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡過(guò)程中具有重要的作用，相關(guān)基因表達(dá)量的改變?yōu)檫M(jìn)一步探索Gpr3受體在調(diào)節(jié)卵