SA-HA水凝膠包載hUC-MSCs治療大鼠腦損傷模型的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury,TBI)是指由外部因素作用于頭部導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺損性疾病，具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率等特點，給社會和家庭帶來沉重負擔，尋找積極有效的治療方法是目前亟待解決的問題。干細胞替代療法給 TBI治療提供了新的策略和希望，人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）來源于人臍帶沃頓膠組織，具有無倫

2、理學爭議，來源廣泛，多向分化潛能、低免疫原性等特點，是組織工程良好的種子細胞。然而移植后成活率低、數(shù)量不足等問題仍然制約著干細胞移植的應用。因此，提供適合移植干細胞生長與存活的微環(huán)境對于提高干細胞生物學活性和治療效果至關(guān)重要。
　　藻酸鹽（sodium alginate，SA）水凝膠組織工程支架具有三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）具有天然相似性，可為細胞生長提供立體支撐，且為細胞的氣體

3、交換、營養(yǎng)輸送及其新陳代謝產(chǎn)物的排出提供良好的傳輸通道。透明質(zhì)酸（hyaluronan,HA）作為天然細胞外基質(zhì)的主要成分之一，可與干細胞表面特異性受體結(jié)合，促進干細胞的增殖、粘附，幫助信號傳導，調(diào)控細胞分化。因此，本課題通過構(gòu)建SA/HA組織工程支架，聯(lián)合hUC-MSCs研究對創(chuàng)傷性腦損傷模型鼠的治療作用。
　　目的
　　本實驗利用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建SA/HA復合功能支架，并對其物化性能等進行表征，對包載hUC-MSCs

4、的SA/HA水凝膠支架進行生物學評價，以提供更適合hUC-MSCs生存的微環(huán)境；在體內(nèi)實驗中，探究hUC-MSCs聯(lián)合SA/HA水凝膠支架對 TBI大鼠的神經(jīng)修復作用及其可能的作用機制，以期為干細胞移植治療TBI提供新的策略和方法。
　　方法
　　1體外實驗研究SA/HA水凝膠支架與hUC-MSCs相容性評價
　　通過內(nèi)部凝膠法制備4組不同配比的藻酸鹽水凝膠，分別為1％-0.8、1%-0.5、0.5%-0.5、0.5%

5、-0.2；掃描電子顯微鏡（SEM）進行水凝膠形貌表征；試管傾斜法檢測不同配比的凝膠時間；冷凍干燥及稱重法測定不同配比的含水率及降解性能；流變儀檢測不同配比的彈性模量；流式細胞儀檢測 hUC-MSCs的表面標記物；通過添加一定比例的透明質(zhì)酸，SA與HA濃度比分別為4:1（S4H1）、2:1（S2H1），構(gòu)建不同配比SA/HA水凝膠支架，包載hUC-MSCs，共分三組，分別為單獨 SA組、S4H1組、S2H1組；通過激光共聚焦顯微鏡觀察 h

6、UC-MSCs在水凝膠中三維分布；Live-Dead染色法檢測干細胞在不同分組中的存活；CCK-8檢測不同分組中干細胞的增殖情況。
　　2體內(nèi)實驗研究SA/HA水凝膠支架聯(lián)合hUC-MSCs對TBI大鼠的神經(jīng)修復作用
　　采用落體撞擊法（Feeney's weight-drop）構(gòu)建大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，隨機分為NaCl組、scaffold組、hUC-MSCs組和scaffold+ hUC-MSCs組。CV染色觀察大鼠腦缺損

7、情況；mNSS評分評估大鼠運動功能恢復；Morris水迷宮法檢測大鼠的學習記憶能力；取出大鼠腦組織，做冰凍切片；免疫組化檢測腦內(nèi)hUC-MSCs的存活和遷移；免疫熒光檢測神經(jīng)元標記物β-III Tubulin和細胞增殖Ki67的陽性表達；提取損傷側(cè)腦組織蛋白和RNA，Western Blot、qRT-PCR檢測組織神經(jīng)分化相關(guān)蛋白和基因（NSE、NEUN、MAP2）的表達，神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF、NGF、NT3的表達變化，細胞凋亡相關(guān)蛋

8、白Bcl2的表達。
　　結(jié)果
　　1、通過內(nèi)部凝膠法制備的藻酸鹽水凝膠外觀呈半透明狀，外形可根據(jù)所用模具的不同任意塑性；通過SEM表征結(jié)果顯示，水凝膠內(nèi)部呈三維多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。凝膠時間、含水率、降解率隨著SA濃度、f值的減小而呈上升趨勢，彈性模量隨著 SA濃度、f值的減小而下降。通過添加適當比例透明質(zhì)酸，檢測hUC-MSCs在水凝膠中的活性發(fā)現(xiàn)，與SA組相比，S4H1、S2H1組中細胞存活率提高（P<0.05）、細胞增殖能力上

9、升（P<0.05），且與HA濃度呈正相關(guān)。
　　2、通過落體撞擊法成功構(gòu)建大鼠腦創(chuàng)傷模型；mNSS評分評估發(fā)現(xiàn)，治療組運動功能恢復顯著（P<0.05）；hUC-MSCs組和scaffold+hUC-MSCs組均能改善大鼠學習記憶能力，且聯(lián)合組效果更加顯著（P<0.05）；hUC-MSCs聯(lián)合支架可減少干細胞于病灶部位的流失，顯著增加損傷部位移植的細胞數(shù)目（P<0.05）；治療組中β-III Tubulin和Ki67表達增加；損傷側(cè)

10、腦組織中，NSE、NEUN、MAP2、BDNF、Bcl2蛋白表達上升（P<0.05），NEUN、MAP2、BDNF、NGF、NT3基因表達水平提高（P<0.05），且聯(lián)合組效果更加明顯。
　　結(jié)論
　　1、內(nèi)部凝膠法可制備任意塑形的可注射性藻酸鹽水凝膠，通過調(diào)整海藻酸鈉濃度、f值的配比，可調(diào)控水凝膠的理化性質(zhì)。
　　2、藻酸鹽水凝膠支架可為hUC-MSCs生長提供三維立體支撐，添加透明質(zhì)酸后，藻酸鹽/透明質(zhì)酸復合水凝膠