慢病毒介導的HDAC1基因沉默對hUC-MSCs神經分化和TBI治療的促進作用.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是一種致死致殘率極高的中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷性疾病，給患者、家庭社會帶來嚴重的負擔。TBI的病理機制、影響因素復雜且不統(tǒng)一。近年來，干細胞替代療法為CNS損傷疾病的治療帶來希望。臍帶源性間充質干細胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell，hUC-MSC)是一

2、類具有強大增殖分化能力且倫理爭議小的干細胞，具有極大的臨床應用價值。但是干細胞在體內存活和分化效率低是干細胞治療的瓶頸。因此，探討更為安全、有效的誘導分化方式對于干細胞移植治療TBI尤為關鍵。
　　表觀遺傳學是研究核苷酸序列不變，但是基因表達發(fā)生有效調控的一門學科。組蛋白乙?；揎検且环N常見的表觀遺傳學修飾方法，它通過改變細胞內乙?；福℉AT）和去乙?；福℉DAC）的動態(tài)平衡來調控干細胞的增殖和定向分化。研究表明，與未分化的干

3、細胞相比，已分化的成熟神經元中HDAC1的表達量降低。HDAC1、HDAC2與其他因子組成阻遏復合物共同調控了干細胞的增殖和分化，而敲除HDAC2可能會抑制神經祖細胞的增殖。因此，深入研究HDAC1在干細胞神經分化和神經修復中的作用和機制，對于治療 CNS損傷性疾病十分必要。
　　目的：
　　本課題以HDAC1為研究靶點，通過體外實驗研究慢病毒介導shRNA靶向下調HDAC1的表達對 hUC-MSCs增殖和神經分化的影響；然

4、后通過體內實驗評價LV-HDAC1shRNA感染的MSCs對TBI小鼠的神經修復和保護作用。該研究旨在揭示HDAC1在調控hUC-MSCs神經分化中的作用機制，為開展干細胞分化的表觀遺傳學調控和提高干細胞對神經系統(tǒng)疾病的臨床治療效果奠定基礎。
　　方法:
　　1.體外實驗研究慢病毒介導shRNA下調HDAC1表達對hUC-MSCs增殖和向神經元樣細胞分化的影響
　　采用組織貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSCs；篩選靶向下調H

5、DAC1表達的shRNA片段，合成慢病毒感染干細胞，建立穩(wěn)定的慢病毒感染細胞株。實驗分為LV-HDAC1shRNA組和hUC-MSCs組。CCK-8檢測各組細胞的增殖、流式細胞術檢測各組細胞的周期、qRT-PCR、Western Blot檢測各組細胞神經分化相關基因在mRNA和蛋白水平的表達、免疫細胞化學檢測各組細胞在神經誘導微環(huán)境下神經元遷移蛋白(Doublecortin，DCX)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific

6、 enolase，NSE)的表達。
　　2.體內實驗研究LV-HDAC1shRNA感染的hUC-MSCs對TBI小鼠的神經修復作用
　　80只C57/BL6J小鼠利用腦立體定位儀和顱腦打擊器制作小鼠皮質損傷創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）模型，隨機分為Sham組、Vehicle組、MSCs組+NCshRNA、MSCs+shRNA組（每組20只）。CV染色評估小鼠腦損傷體積；采用干濕重法檢測TBI后腦水腫情況；采用mNSS評分評估小鼠神

7、經功能缺損情況；采用Morris水迷宮法、新事物識別實驗檢測小鼠的學習記憶能力；采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測小鼠血清中的SOD、MDA、GSH、GSH-Px、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表達情況；采用qRT-PCR、Western Blot分別檢測小鼠病灶部位神經分化相關基因表達變化和損傷部位乙?；?。
　　結果:
　　1.與對照組相比，LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs后HDAC1的表達下調，而

8、H3K9Ac表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LV-HDAC1 shRNA在3d后可明顯促進hUC-MSCs的增殖，增加S期細胞比例（P<0.05）；在相同神經誘導分化條件下LV-HDAC1 shRNA組神經分化效率增加，細胞中DCX、NSE的表達明顯升高（P<0.05），而神經分化相關基因（Ngn2、Mash1等）的表達顯著增加（P<0.05）。
　　2.成功建立TBI小鼠模型；通過Morris水迷宮、新事物識別實驗

9、、腦含水量檢測發(fā)現(xiàn)，與Vehicle組相比，MSCs+NCshRNA組、MSCs+shRNA組學習、記憶能力明顯改善（P<0.05）、腦水腫體積顯著減?。≒<0.05）；ELISA結果顯示各治療組28d血清中的SOD、GSH、GSH-Px、IL-4、IL-10的表達顯著增加（P<0.05），而MDA、TNF-α、IL-1β的表達明顯降低（P<0.05）；Western Blot結果顯示：術后14d，與Vehicle組相比，MSCs+sh

10、RNA組小鼠損傷部位乙?；皆黾用黠@（P<0.05）。qRT-PCR結果顯示：術后28d，較Vehicle組，MSCs+shRNA組病灶部位神經分化相關基因DCX、MAP2和海馬中神經營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT3的表達均有明顯上調（P<0.05）。
　　結論:
　　1. LV-HDAC1 shRNA感染hUC-MSC后，HDAC1的表達被靶向下調、細胞乙?；教岣摺Ｍ瑫r，細胞增殖變快、S期細胞比例增加，調控神經發(fā)育相