大鼠HDAC1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其體外調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞心肌定向分化.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建及鑒定用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的HDAC1－RNAi慢病毒載體，評(píng)價(jià)RNAi慢病毒載體介導(dǎo)的對(duì)組蛋白去乙?；?（HDAC1）基因表達(dá)的抑制效果并檢測(cè)心肌早期發(fā)育相關(guān)結(jié)構(gòu)功能蛋白表達(dá)，初步探討乙?；揎椩诟杉?xì)胞特化心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，為基因聯(lián)合干細(xì)胞治療急性心肌梗死提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．293T細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)，用0.25％胰酶消化細(xì)胞，以1：4~1:2

2、0傳代擴(kuò)增。
　　2．全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs），當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)，用胰酶-EDTA(0.25％：0.05％)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)鑒定。
　　3．根據(jù)HDAC1基因信息，設(shè)計(jì)4對(duì)小干擾序列及1對(duì)陰性對(duì)照(NC)序列，將靶向HDAC1的shRNA表達(dá)序列連接到慢病毒載體

3、pGCSIL-GFP中，獲得 pGCSIL-GFP-shHDAC1重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定正確后與慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper1.0及pHelper2.0通過(guò)Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞293T，包裝產(chǎn)生病毒液，逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度。
　　4．包裝好的pGCSIL-GFP-NC Lentivirus以MOI0、1、10、100感染BMSCs，分別在感染后12h，24h，48h，72h后用.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情

4、況，流式細(xì)胞術(shù)（488 nm波長(zhǎng)）檢測(cè)感染效率，篩選出獲得最佳感染效率的MOI值及時(shí)間。
　　5．包裝好的5組病毒以最佳MOI值感染 BMSCs，48h后收集細(xì)胞，RT-QPCR檢測(cè)各組HDAC1 mRNA表達(dá)情況；Western Blot檢測(cè)各組 HDAC1表達(dá)情況，篩選出HDAC1基因沉默效率最佳的一組病毒。
　　6．篩選出的病毒以最佳MOI感染BMSCs，48h后觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)；收集細(xì)胞，RT-QPCR分別檢測(cè)心肌發(fā)育相

5、關(guān)基因GATA-4、NKx2.5，心肌結(jié)構(gòu)相關(guān)基因肌鈣蛋白（CTnT）、肌球蛋白重鏈（MHC）及縫隙鏈接蛋白43（Connexin-43）mRNA的表達(dá)情況；
　　7．?dāng)?shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.293T細(xì)胞復(fù)蘇后，24h單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多邊形，形態(tài)均一；1：4~1:20傳代后生長(zhǎng)狀態(tài)

6、良好，72h即可傳代或凍存。
　　2．原代及傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均呈成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，觀察形態(tài)較均一、飽滿，以1：2~1:4的分種率在72h小時(shí)內(nèi)可長(zhǎng)滿，形態(tài)亦多呈長(zhǎng)梭性，呈極性排列。第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞低表達(dá)造血標(biāo)志CD34(0.64％)、CD45(0.35％)，強(qiáng)表達(dá)CD29(99.86％)，CD44(99.47％)，CD90（98.97％）等基質(zhì)細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志。
　　3．核苷酸序列檢測(cè)結(jié)果表明，siRN

7、A表達(dá)模板成功構(gòu)建于pGCSIL-EGFP載體上，序列與目的序列相同。3質(zhì)粒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒分別命名為L(zhǎng)V-HDAC1-shRNA1、LV-HDAC1-shRNA2、LV-HDAC1-shRNA3、LV-HDAC1-shRNA4、LV-NC-shRNA；逐孔稀釋法測(cè)定病毒液的滴度分別為9×108TU/ml、8×108TU/ml、9×108TU/ml、9×108TU/ml、1.5×109TU/ml。
　　4．pGCSIL-GFP-

8、NC Lentivirus感染BMSCs12h后可觀測(cè)到EGFP表達(dá)，48h達(dá)到高峰，強(qiáng)綠色熒光可持續(xù)至72h后；MOI為1~10時(shí)，感染效率不足70%；MOI為100時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，感染效率達(dá)90%以上，流式細(xì)胞儀測(cè)得EGFP陽(yáng)性標(biāo)記率為93.65%。
　　5．HDAC1 mRNA在各組樣本均有表達(dá)，各干擾病毒感染組的表達(dá)量均顯著低于正常對(duì)照和陰性對(duì)照組，P值<0.05；正常對(duì)照組HDAC1

9、 mRNA的表達(dá)量分別為干擾組的32倍、11倍、13倍、96倍；各干擾組沉默效率達(dá)到90%以上。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析表明，LV-HDAC-shRNA2和LV-HDAC1-shRNA3感染組間差異無(wú)顯著性；LV-HDAC1-shRNA1和LV-HDAC1-shRNA4感染組間差異無(wú)顯著性；Western blot結(jié)果分析與PCR結(jié)果吻合，各干擾組沉默效率達(dá)30%以上。即所構(gòu)建的4個(gè)針對(duì)HDAC1特異siRNA載體都對(duì)HDAC1的表達(dá)均有抑制作用，

10、其中，LV-HDAC1-shRNA1和LV-HDAC1-shRNA4相比于LV-HDAC-shRNA2和LV-HDAC1-shRNA3，對(duì)目的基因的抑制效果更為明顯。
　　6．篩選出的LV-HDAC1-shRNA4感染BMSCs，48h后細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別；RT-QPCR結(jié)果顯示干擾組干擾組心肌發(fā)育相關(guān)基因 GATA-4、NKx2.5，心肌結(jié)構(gòu)相關(guān)基因肌鈣蛋白（CTnT）、肌球蛋白重鏈（MHC）及縫隙鏈接蛋白43（Co

11、nnexin-43）的mRNA表達(dá)水平較正常組升高，P值<0.05。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了大鼠 HDAC1基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體LV-HDAC1-shRNA，并通過(guò)慢病毒包裝體系獲得了較高滴度的病毒液。
　　2.慢病毒載體攜帶的外源基因能夠在受感染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)，且LV-HDAC1-shRNA在體外能特異且高效抑制BMSCs中HDAC1基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平；
　　3.通過(guò)RN