p16表達(dá)下調(diào)對(duì)hUC-MSCs和APP+鼠的抗衰老作用.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，具體表現(xiàn)為記憶能力降低、執(zhí)行能力降低等行為的改變。隨著年齡的增加，AD的發(fā)病率也逐年增加，目前我國(guó)正面臨日趨嚴(yán)重的人口老齡化問(wèn)題，60歲以上老人達(dá)到2.1億。因此，尋求 AD有效的防治療法是亟待解決的重大問(wèn)題。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）是一類具有高度自我更新和分化潛能的成體干細(xì)胞，來(lái)源于臍帶沃頓膠（

2、Wharton’s Jelly）組織，具有來(lái)源廣泛、低免疫反應(yīng)、使用安全可靠、無(wú)倫理爭(zhēng)議以及體外易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，是組織工程和干細(xì)胞替代療法的種子細(xì)胞,為AD治療帶來(lái)希望。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植治療AD可以改善AD的學(xué)習(xí)記憶功能，延緩衰老。但是隨著傳代次數(shù)的增加，干細(xì)胞不僅在形態(tài)上表現(xiàn)出衰老的特征，增殖和分化能力也隨之減弱。因此，臨床和基礎(chǔ)研究多選用3-5代的干細(xì)胞進(jìn)行移植，有限的細(xì)胞數(shù)量極大地限制了干細(xì)胞的使用。因此，研

3、究調(diào)控干細(xì)胞衰老的關(guān)鍵基因，改善干細(xì)胞微環(huán)境是提高干細(xì)胞活性和療效的關(guān)鍵。
　　p16基因是美國(guó)冷泉實(shí)驗(yàn)室Kamb等于1993年發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因，同時(shí)又是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控基因。p16能夠阻遏周期蛋白D（cyclinD）與周期蛋白依賴性蛋白激酶4/6（CDK4/CDK6）的結(jié)合，抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）的磷酸化，而未磷酸化的RB則不能與E2F結(jié)合啟動(dòng)DNA的復(fù)制，從而將細(xì)胞周期阻斷在G1/S檢查點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。課題組前期

4、研究發(fā)現(xiàn)p16基因高表達(dá)能導(dǎo)致293細(xì)胞的衰老，但是p16與hUC-MSCs和AD鼠的衰老關(guān)系還不清楚。因此，本課題通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究p16表達(dá)下調(diào)對(duì)hUC-MSCs和APP+鼠衰老的調(diào)控。
　　目的:本研究以p16基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，以慢病毒為載體，利用RNAi技術(shù)下調(diào)P15hUC-MSCs中p16基因的表達(dá)，進(jìn)而觀察p16基因表達(dá)下調(diào)對(duì)hUC-MSCs衰老的影響；同時(shí)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，以APP+鼠為研究對(duì)象，研究p16表達(dá)下調(diào)的P1

5、5 hUC-MSCs對(duì)APP+鼠的神經(jīng)修復(fù)和抗衰老作用。
　　方法:
　　1.靶向下調(diào)p16基因表達(dá)的siRNA片段的篩選和慢病毒構(gòu)建
　　取剖腹產(chǎn)健康新生兒臍帶，體外分離培養(yǎng) hUC-MSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUC-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD90、CD34和CD45的表達(dá)，收集3、10、15代的細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)p16的表達(dá)，β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)不同代數(shù)hUC-MSCs的衰老程度。篩選有效下調(diào)p16

6、基因表達(dá)的siRNA（sip16），構(gòu)建包含sip16的慢病毒(LV-shp16)，LV-shp16感染hUC-MSCs觀察綠色熒光表達(dá)以及檢測(cè)P16蛋白表達(dá)。
　　2.p16基因表達(dá)下調(diào)對(duì)hUC-MSCs衰老的影響
　　體外實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為P3組、P15組、LV組和LV-shp16組。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖；PI染色和FITC染色檢測(cè)各組細(xì)胞的周期和凋亡；β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)各組細(xì)胞的衰老狀態(tài)；qRT-PCR

7、和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中細(xì)胞周期關(guān)鍵基因（CDK4、CDK6、RB1、p-RB1）以及衰老相關(guān)基因（p16、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2）的表達(dá)變化。
　　3.p16表達(dá)下調(diào)的hUC-MSCs對(duì)APP+鼠神經(jīng)功能的修復(fù)作用
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，取4月齡APP+雄鼠40只，隨機(jī)分為5組，分別為P3hUC-MSCs移植組（P3組）、空白組（AD組）、P15 hUC-MSCs移植組（P15組）、LV

8、感染的P15 hUC-MSCs移植組（LV組）、LV-shp16感染的P15 hUC-MSCs移植組（LV-shp16組），同時(shí)以遺傳背景相同的非轉(zhuǎn)基因的野生鼠作為正常對(duì)照組（WT組）。P3組、P15組、LV組、LV-shp16組均采用尾靜脈注射hUC-MSCs的方式治療，每只APP+鼠注射細(xì)胞量為1X106個(gè)cell/200ul，每周注射一次，連續(xù)注射四周，其余各組注射生理鹽水。細(xì)胞移植28天后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠行為學(xué)的

9、改變；心臟取血，TBA法和羥胺法檢測(cè)小鼠血清中丙二醛（Malondialdehyd，MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活力變化；免疫組化檢測(cè)小鼠腦組織MAB1281的表達(dá)，檢測(cè)雙腎上腺皮脂激素（DCX）、βⅢ微管蛋白（βⅢ-Tubulin）以及淀粉樣前體蛋白（APP）的表達(dá)；提取小鼠海馬組織RNA和蛋白，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期關(guān)鍵基因(CDK4、CDK6、RB1、

10、p-RB1)、衰老相關(guān)基因(p16、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2)、凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、Bcl-2)以及Tau、p-Tau的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、隨著傳代次數(shù)的增加，hUC-MSCs細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)出形態(tài)扁平化，易脫壁的特點(diǎn)，β-半乳糖苷酶染色發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增加(P<0.05)；qRT-PCR結(jié)果顯示P3、P10、P15hUC-MSCs中p16 mRNA的表達(dá)逐漸增加(P<0.05

11、)。
　　2、成功篩選出能有效下調(diào)p16表達(dá)的siRNA，合成包含此siRNA的慢病毒并成功感染hUC-MSCs；與P15組相比，LV-shp16能促進(jìn)P15 hUC-MSCs的增殖、促使細(xì)胞周期進(jìn)入S期、抑制P15hUC-MSCs的早期凋亡、降低hUC-MSCs的衰老程度(P<0.05)；同時(shí)，LV-shp16組中p16、p53、p21 mRNA和蛋白表達(dá)降低，RB1 mRNA和蛋白表達(dá)不變，而pCNA、sirt1、sirt2、

12、CDK4、CDK6、p-RB1 mRNA和蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。
　　3、細(xì)胞移植期間，APP+鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)不良反應(yīng)；與AD組相比，各處理組均有一定的抗衰老作用；與P15組相比，LV-shp16組小鼠逃避潛伏期減少、逃避潛伏期距離縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)、第一象限停留時(shí)間增加(P<0.05)；LV-shp16組血清SOD活力升高，MDA活力降低(P<0.05)；LV-shp16組海馬組織中p16、p53、p21、Caspa

13、se-3、p-Tau蛋白表達(dá)降低，pCNA、sirt1、sirt2、CDK4、CDK6、p-RB1、Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，RB1、Tau蛋白表達(dá)變化不明顯；此外，LV-shp16組腦組織中 MAB1281陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，DCX、βⅢ-Tubulin的表達(dá)增加，而APP的表達(dá)減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，hUC-MSCs開始出現(xiàn)衰老，p16的表達(dá)與衰老呈正相關(guān)。

14、　　2、下調(diào)P15 hUC-MSCs中 p16基因的表達(dá)能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)鍵基因(CDK4、CDK6、p-RB1)以及衰老相關(guān)基因(p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2)的表達(dá)，延緩和改善hUC-MSCs的衰老，促進(jìn)hUC-MSCs的增殖。
　　3、通過(guò)調(diào)節(jié)CDK4、CDK6、p-RB1、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2等基因的表達(dá),LV-shp16能促進(jìn)hUC-MSCs的遷移和神經(jīng)分化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡