氧化應(yīng)激通過(guò)P38sapk途徑上調(diào)P16基因表達(dá)引起卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的衰老.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、第一部分:小鼠卵巢卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定新方法
  目的:建立一種簡(jiǎn)單易行的分離未成年小鼠卵巢卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的方法,并對(duì)分離細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和功能鑒定。
  方法:選取未成年C57BL/6小鼠(21-25d)的卵巢組織,在體式顯微鏡下分離干凈周圍組織并去包膜,用機(jī)械法去除顆粒細(xì)胞,將殘余組織在LSP培養(yǎng)基清洗兩次后用膠原酶Ⅳ-DNase(4g/L膠原酶,10g/L DNase和10g/L BSA溶于M199培養(yǎng)液)在3

2、7℃,5%CO2培養(yǎng)箱中消化分離卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞,用含10%胎牛血清及10ng/ml雄激素的McCoy’s 5a培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、蛋白印跡技術(shù)、激素檢測(cè)對(duì)培養(yǎng)的卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。通過(guò)卵泡膜-間質(zhì)細(xì)胞在不同濃度的FSH和LH條件下激素水平的改變,檢測(cè)該細(xì)胞激素分泌反應(yīng)性。
  結(jié)果:通過(guò)上述分離方法得到的細(xì)胞存活率在90%以上,細(xì)胞在培養(yǎng)24小時(shí)內(nèi)貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)成梭形和不規(guī)則三角形,且能在含10%胎牛

3、血清及10ng/ml雄激素McCoy’s 5a培養(yǎng)基中分裂增殖。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞AMH蛋白陽(yáng)性表達(dá)<5%,而p450scc蛋呈陽(yáng)性表達(dá)>95%;貼壁細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)之后雄激素濃度為649.22±12.3ng/dl(n=3),雌激素濃度<10.7pg/ml(n=3);0.1U/ml LH組的睪酮水平明顯高于FSH組和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組(p<0.05)。0.5U/ml LH組的睪酮水平顯著高于0.1U/ml組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

4、<0.05);加入LH0.5U/ml組、1U/ml組,2U/ml組之間睪酮水平未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FSH組睪酮水平和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),在這三組中均未檢測(cè)到雌激素水平的改變。
  結(jié)論:通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的分離和培養(yǎng)方法可以得到大量貼壁生長(zhǎng)的卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞,其中很少有顆粒細(xì)胞的混雜,此方法可以快速、高效的進(jìn)行小鼠卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)。
  第二部分:氧化應(yīng)激通過(guò)P38sapk途徑上調(diào)P

5、16基因表達(dá)引起卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的衰老
  目的:探討在卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激是否通過(guò)P38mapk途徑上調(diào)P16基因的表達(dá),從而導(dǎo)致卵巢中卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞衰老的發(fā)生。
  方法:免疫組織化學(xué)檢測(cè)12周、24周、48周各年齡階段卵巢組織中P38、P16、氧化損傷指標(biāo)(8-OHdG)的表達(dá)變化,蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)P38,P-P38、P16以及氧化損傷指標(biāo)的表達(dá)改變,通過(guò)機(jī)械法聯(lián)合膠原酶Ⅳ-DNase消化法分離提純卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞,C

6、CK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖分裂能力,β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老程度,全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定不同處理因素細(xì)胞激素分泌水平。
  結(jié)果:通過(guò)免疫組織化學(xué)和蛋白印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)卵巢組織中P38,P16,氧化損傷指標(biāo)主要表達(dá)于卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞且隨增齡而增加(p<0.05);50umol/L H2O2作用4小時(shí)是引起卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞衰老的適宜濃度,5mmol/L的NAC可以抵抗50umol/L H2O2的氧化應(yīng)激,10ug/ml的P38特

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