大鼠新型閉合性顱腦損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 長期以來，顱腦損傷的研究受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，他們從不同角度對顱腦損傷的發(fā)生原因、生物力學(xué)機(jī)制、病理生理學(xué)、病理形態(tài)學(xué)及分子病理學(xué)變化等方面進(jìn)行了廣泛而深人的研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立一直是認(rèn)識和研究顱腦損傷病理機(jī)制與臨床救治的一個(gè)重要組成部分。建立一個(gè)既能反映人類顱腦損傷的特點(diǎn)，又便于進(jìn)行觀察和施加處理因素的致傷模型，是我們長期以來尋求的主要目標(biāo)之一。通過各種致傷模型，可以模擬顱腦損傷的發(fā)生過程，研究顱腦損傷原發(fā)損傷

2、和繼發(fā)損害的機(jī)制。 根據(jù)顱腦解剖結(jié)構(gòu)的破壞情況，可將損傷動(dòng)物模型分為開放性和閉合性TBI兩大類。閉合性顱腦損傷模型按其致傷方式和機(jī)制的不同，大致可分為落體撞擊法、液壓沖擊法、加速負(fù)荷致傷法、控制性皮層挫傷等幾種類型。 自由落體TBI模型是以不同高度不同重量的重錘以自由落體方式撞擊，造成不同程度的閉合性TBI，它類似臨床上的閉合性顱腦加速傷。但是該模型不易準(zhǔn)確控制打擊強(qiáng)度，難以制作精細(xì)分級的動(dòng)物腦損傷模型，同時(shí)致傷過程中實(shí)

3、驗(yàn)動(dòng)物死亡率較高。液壓致傷模型是在保持硬腦膜完整前提下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顱骨開窗，通過向一密閉顱腔內(nèi)快速注入一定量的生理鹽水，造成腦組織的變形和移位導(dǎo)致TBI。該模型受外來因素干擾小，不受顱骨個(gè)體差異影響，重復(fù)性好。致傷力定量準(zhǔn)確，可復(fù)制出不同程度顱腦損傷模型。然而該裝置致傷機(jī)制與人類受傷機(jī)制不盡一致，因而不適用于顱腦損傷的生物力學(xué)的研究。該模型制作復(fù)雜，由于手術(shù)和麻醉的干擾，術(shù)后不容易觀察到真實(shí)腦損傷CNS癥狀。旋轉(zhuǎn)模型是將動(dòng)物頭部固定后，將

4、頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)引起腦內(nèi)產(chǎn)生剪切應(yīng)力，從而導(dǎo)致彌漫性TBI。此類裝置，能夠單一施加旋轉(zhuǎn)加速度致傷，在實(shí)驗(yàn)中較好地模擬了彌漫性軸索損傷(DAI)的病理改變。力學(xué)參數(shù)可調(diào)控，有利于生物力學(xué)分析。然而所施加的載荷和臨床實(shí)際致傷暴力不一致，而且儀器比較復(fù)雜，成本比較高，推廣不易。 雖然彌漫性軸索損傷DAI是臨床閉合性顱腦損傷的重要形態(tài)學(xué)特征，但是采用以往的模型制作方法如液壓沖擊法、控制性皮層沖擊法卻少有成功建立的大鼠DAI模型。因此我們需要

5、繼續(xù)探索使用鼠類制作彌漫性軸索損傷的有效方法。 第一部分大鼠新型閉合性顱腦損傷模型的建立及其評估 本研究的第一個(gè)目的就是制造出可控制的大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷模型的致傷裝置，然后利用此裝置建立評價(jià)損傷程度的參數(shù)。在建立參數(shù)之后，制造大鼠閉合性彌漫性TBI動(dòng)物模型。通過觀察大鼠致傷后的早期神經(jīng)反射、病理生理學(xué)改變、組織學(xué)改變、腦水腫及血腦屏障改變、血清NO及ET-1變化、腦微循環(huán)灌注量改變等幾方面，評估建立的輕型閉合性彌漫性TBI

6、模型的有效性。 實(shí)驗(yàn)一彈簧式生物打擊裝置的研制與應(yīng)用 目的 為了彌補(bǔ)前述動(dòng)物致傷裝置的缺陷，自行設(shè)計(jì)和研制一套可控制的小型生物致傷裝置，為顱腦損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)設(shè)備。 方法 采用彈簧驅(qū)動(dòng)鋼棍，以不同角度標(biāo)示不同打擊力度，建立大鼠腦損傷動(dòng)物模型，觀察傷后大鼠存活情況、病理改變及神經(jīng)行為變化。 結(jié)果 利用可調(diào)控的該裝置對大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同致傷條件下可造成動(dòng)物頭部的不同程度的

7、創(chuàng)傷。 結(jié)論 本裝置具有操作方便、定量可控、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以成功便地制作出所需的大鼠顱腦損傷模型，是較理想的致傷裝置。 實(shí)驗(yàn)二 大鼠新型閉合性顱腦損傷模型的建立及其評估 目的 為了評估自制的新型致傷模型的有效性及傷后腦的改變是否符合實(shí)驗(yàn)要求。 材料與方法 取220只大鼠隨機(jī)分成七組。 第一組20只，損傷及對照各10只，觀察損傷后表現(xiàn)及早期神經(jīng)反射檢查。 第二組2

8、0只，損傷及對照各10只，病理生理學(xué)觀察 第三組20只，損傷10只及對照10只，作激光多普勒腦微循環(huán)測量 第四組40只，損傷35只及對照5只，做形態(tài)學(xué)觀察(HE染色、髓鞘染色、銀染、掃描電鏡觀察及透射電鏡觀察) 第五組40只，損傷35只及對照5只，作腦水腫測量 第六組40只，損傷35只及對照5只，作血腦屏障測量 第七組40只，損傷35只及對照5只，作N0，ET檢測 結(jié)果 1．損傷組

9、大鼠平均昏迷30分鐘。本實(shí)驗(yàn)中大鼠致傷后立即出現(xiàn)短暫呼吸停止，3分鐘后恢復(fù)自主呼吸，15分鐘后呼吸與損傷前頻率、幅度一致。大鼠傷后出現(xiàn)一過性心率加快。損傷后血壓立即上升，稍候逐漸下降，1分鐘后血壓下降到最低，以后逐漸恢復(fù)，至30分鐘后恢復(fù)到損傷前水平。 2．模型組大鼠在受傷后5分鐘腦血流PU(perfusion unit， PU)值較對照組降低31％，至30min降至最低，約為正常對照組的57％，1小時(shí)后PU值逐步回升，但至2

10、小時(shí)，PU值仍然較對照組低。 3．顯微鏡下可以觀察到損傷組大鼠腦干、小腦、額極和海馬等部位神經(jīng)細(xì)胞有不同程度損傷的改變，傷后3小時(shí)可見彌漫性軸索損傷表現(xiàn)。髓鞘染色顯示損傷后大鼠均有不同程度的DAI改變，嗜銀染色6h可見較為明顯的收縮球形成，12h可見典型軸索收縮球。掃描電鏡下全腦彌漫的神經(jīng)纖維軸索腫脹、排列紊亂、扭曲或呈波浪狀變形、斷裂，髓鞘不規(guī)則脫落或呈套袖樣剝離。透射電鏡下可見軸索髓鞘出現(xiàn)分離、腫脹、內(nèi)折，有髓纖維節(jié)段性膨大

11、，髓鞘板層松散，呈洋蔥樣變或空泡樣變。 4．傷后15min，大鼠腦皮質(zhì)、海馬含水量開始升高，傷后1h含水量顯著增高，傷后1d達(dá)高峰。 5．致傷后15min，大鼠腦皮質(zhì)、海馬組織的伊文思藍(lán)含量明顯升高，6小時(shí)達(dá)高峰后逐漸下降。 6．損傷后30min，大鼠血漿ET開始升高，3小時(shí)明顯升高，6小時(shí)達(dá)到高峰后逐漸下降，24小時(shí)含量下降，但仍然高于對照組。大鼠損傷后15min血漿NO開始下降，1小時(shí)下降至最低后逐漸上升，至

12、24小時(shí)達(dá)到高峰。 結(jié)論 我們成功建立了一種新型閉合性彌漫性TBI動(dòng)物模型。本模型所致顱腦損傷與臨床加速性顱腦損傷機(jī)制類似，成功地復(fù)制出顱腦損傷的多個(gè)重要臨床特征。該模型所導(dǎo)致的病理生理改變、病理形態(tài)學(xué)改變、血清學(xué)改變、腦水腫及血腦屏障改變、腦局部血流改變等與以往報(bào)導(dǎo)的彌漫性軸索損傷動(dòng)物模型一致。我們制作的模型操作簡單、重復(fù)性強(qiáng)，適合于閉合性TBI后的相關(guān)研究。 本研究的第二個(gè)目的是在我們建立的輕型閉合性彌漫性顱

13、腦損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察大鼠顱腦損傷后不同頻率刺激下腦干聽覺誘發(fā)電位(BAEP)的波峰潛伏期(peak latency，PL)、波峰間潛伏期(interpeak latency，IPL)、波峰潛伏期比值(peak latencyratio，PL Ratio)的變化，探討不同頻率刺激下BAEP對顱腦損傷的診斷價(jià)值。同時(shí)對其MTBI后BAEP與腦組織損傷的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行觀察，探討B(tài)AEP在閉合性顱腦損傷后聽覺功能障礙評估的價(jià)值，為臨床實(shí)踐及法

14、醫(yī)臨床學(xué)鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的 觀察大鼠顱腦損傷后不同頻率刺激下腦干聽覺誘發(fā)電位(BAEP)的變化，為顱腦損傷的早期臨床診斷和法醫(yī)學(xué)活體傷害鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 使用自制彈簧式小型生物打擊機(jī)打擊大鼠顱頂部，制造閉合性彌漫性顱腦損傷模型。分別于傷后6h、12h、2d、4d以10Hz低刺激率、50Hz高刺激率記錄大鼠腦干聽覺誘發(fā)電位，將各組結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果 TBI后50 Hz高刺激率BAEP的第2d、4d組

15、V波PL和6h、12h、2d、4d組III—V波IPL，較對照組延長(P<0.05)。各組之間10Hz低刺激率BAEP差異無顯著性意義(P>0.05)。各組10Hz、50Hz刺激率BAEP PL比值中ⅢⅡ／Ⅰ、Ⅳ／Ⅱ、V／Ⅱ、Ⅳ／Ⅲ、V／Ⅲ比值無明顯損傷后改變。 結(jié)論 高刺激率BAEP測試是早期診斷顱腦損傷的可靠方法，其敏感性優(yōu)于低刺激率BAEP測試。 實(shí)驗(yàn)二閉合性顱腦損傷后大鼠BAEP及腦損傷的動(dòng)態(tài)變化 目的

16、 觀察大鼠閉合性彌漫性顱腦損傷后腦干聽覺誘發(fā)電位(brainstem auditory evoked potential，BAEP)的動(dòng)態(tài)改變及腦組織病理學(xué)變化，探討B(tài)AEP在顱腦損傷后評估聽覺功能障礙的價(jià)值。 方法 使用自制彈簧式小型生物打擊機(jī)打擊大鼠顱頂部，制造閉合性彌漫性輕型顱腦損傷模型。120只雄性SD大鼠隨機(jī)分成對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分別劃分為病理組及BAEP檢測組。在光鏡下觀察對照組及傷后15min、1h、3h、

17、6h、12h、ld、2d、4d、7d、10d、14d、21d等時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織病理學(xué)改變，干-濕法檢測腦組織含水量。分別于傷前、傷后各時(shí)間點(diǎn)以50Hz刺激率記錄大鼠BAEP，將各組結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果 損傷后15min，50 Hz刺激率BAEP的Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ—Ⅴ IPL即較損傷前延長(p<0.05)，至6h-12h，Ⅲ、Ⅴ PL較損傷前延長。損傷后1d一2d，Ⅲ、Ⅴ PL和Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅴ IPL均較損傷前顯著延長(P<0