小分子水凝膠攜帶miR-499轉(zhuǎn)染的MSCs移植治療大鼠急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目的：①探討miR-499對誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化的作用。②觀察小分子水凝膠攜帶過表達(dá)miR-499的MSCs移植對AMI大鼠心臟功能的影響以及植入MSCs存活、滯留、分化等情況。
　　方法：⑴將用嘌呤霉素篩選后帶有GFP熒光標(biāo)記和嘌呤霉素抗性的miR-499慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs，48小時后檢測感染效率，以MOI=200確定慢病毒感染的最佳濃度；7天后qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-499、心肌特異性基因GATA4、Nkx2

2、.5、cTnI的表達(dá)情況。⑵在MSCs中過表達(dá) miR-499后，qRT-PCR檢測心肌特異性基因 GATA4、Nkx2.5、cTnI mRNA的表達(dá)變化。⑶通過結(jié)扎S-D大鼠冠狀動脈左前降支的方法建立急性心肌梗死模型，1周后將成模大鼠隨機分為5組：PBS注射組、MSCs注射組、SMHs注射組、miR-499 MSCs注射組、SMHs+miR-499 MSCs注射組。⑷細(xì)胞移植術(shù)后4周行心臟彩超檢測心功能。⑸取材立即冰凍切片，熒光倒置顯

3、微鏡下觀察各組細(xì)胞滯留情況，免疫熒光組織化學(xué)檢測植入MSCs中cTnT、Desmin、Cx43等蛋白的表達(dá)情況。⑹石蠟切片，CD31免疫組織化學(xué)染色計算各組梗死區(qū)以及梗死周邊區(qū)新生血管數(shù)，HE染色、Masson三色染色觀察各組心肌梗死區(qū)心肌纖維化程度、室壁厚度以及梗死面積。
　　結(jié)果：①經(jīng)篩選穩(wěn)定表達(dá)miR-499的MSCs與NC-puro-GFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染的MSCs比較，qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-499、心肌特異性基因

4、GATA4、Nkx2.5、cTnI的表達(dá)變化，前者的表達(dá)明顯上升。②細(xì)胞移植治療4周后，各組動物行心臟彩超檢測心功能，結(jié)果顯示各處理組均有不同程度的改善，SMHs+miR-499 MSCs組最明顯，MSCs組、SMHs組、miR-499 MSCs組次之；③取材冰凍切片，熒光倒置顯微鏡下觀察，SMHs+miR-499 MSCs組細(xì)胞滯留明顯增多，MSCs組、miR-499 MSCs組較少；④免疫熒光組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，與MSCs組比較，

5、SMHs+miR-499 MSCs組心肌特異性蛋白cTnT、Desmin、Cx-43的表達(dá)最強，miR-499 MSCs組次之；⑤石蠟切片，HE染色、Masson三色染色可見，與PBS組比較，SMHs+miR-499 MSCs組心梗死區(qū)面積明顯減小、纖維化程度低、室壁明顯增厚，MSCs組、SMHs組、miR-499 MSCs組也有所改善，但次于SMHs+miR-499 MSCs組；⑥CD31免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SMHs+miR-4

6、99 MSCs組梗死區(qū)新生血管數(shù)最多，但梗死周邊區(qū)新生血管數(shù)與PBS組比較無明顯差異，其他各組梗死周邊區(qū)新生血管數(shù)增多，但各組間比較無顯著差異。
　　結(jié)論：⑴miR-499可誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化。⑵在體內(nèi)通過心肌內(nèi)注射用SMHs三維包裹過表達(dá)miR-499的MSCs更有利于MSCs移植后向心肌細(xì)胞分化，減輕心肌纖維化程度，促進(jìn)梗死區(qū)血管再生，改善心臟功能。SMHs體內(nèi)移植使細(xì)胞滯留明顯增多；miR-499與SMHs聯(lián)合應(yīng)用