JAZF1基因抑制對糖脂代謝及相關(guān)信號通路的影響.pdf

1、第一部分:構(gòu)建及篩選鑒定小鼠JAZF1-shRNA真核表達載體。
　　目的：構(gòu)建小鼠JAZF1-shRNA表達載體并構(gòu)建JAZF1基因下調(diào)細胞模型，為下一步研究JAZF1抑制條件下的糖脂代謝提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：針對小鼠JAZF1基因序列設(shè)計合成3條shRNA序列，載體為pGenesil-1-2，啟動子選擇為mU6，構(gòu)建pGenesil-JAZF1抑制質(zhì)粒1，2，3。轉(zhuǎn)染小鼠Hepal-6細胞，運用熒光定量PCR技術(shù)篩選

2、最佳抑制質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)染小鼠3T3-11細胞，對抑制效率進行驗證。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了3條pGenesil-JAZF1重組質(zhì)粒，其中pGenesil-JAZF1-3號抑制質(zhì)粒篩選為最佳抑制片段。成功構(gòu)建JAZF1基因表達下調(diào)細胞膜型，在hepal-6細胞中抑制率為78-84％；在轉(zhuǎn)染誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞，其表達顯著低于空白對照約57.3％。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建JAZF1-shRNA表達載體，篩選出抑制效果最佳的

3、質(zhì)粒，并構(gòu)建JAZF1基因下調(diào)細胞模型。
　　第二部分: JAZF1基因抑制對脂肪細胞和肝細胞糖脂代謝的影響
　　目的：在JAZF1基因表達下調(diào)的細胞模型基礎(chǔ)上，探討JAZF1基因抑制對脂肪細胞及肝細胞糖脂代謝的影響。
　　方法：小鼠脂肪細胞及肝細胞分別轉(zhuǎn)染最佳抑制效率的pGenesil-JAZF1-3號質(zhì)粒，應(yīng)用免疫熒光法檢測細胞糖代謝相關(guān)蛋白的表達，Western blot法及細胞免疫熒光法檢測兩種細胞糖脂代謝相關(guān)

4、蛋白表達的影響。細胞糖代謝指標的mRNA水平變化采用實時熒光PCR技術(shù)檢測，脂肪細胞甘油三酯含量變化用油紅O染色半定量檢測，運用氫三放射示蹤法檢測脂肪細胞糖攝取率。
　　結(jié)果：在肝細胞中，糖代謝相關(guān)基因GLUT1和GLLIT4 mRNA表達下降(P<0.05)，GLUT1蛋白表達升高但無統(tǒng)計學差異，G-6-Pase蛋白表達降低但無統(tǒng)計學差異，PEPCK蛋白表達水平降低(P<0.05)；脂代謝相關(guān)基因HSL蛋白表達降低，PPAR-γ

5、蛋白表達升高，但無統(tǒng)計學差異。在脂肪細胞中，糖代謝相關(guān)基因GLUT1和GLUT4 mRNA表達下降(P<0.05)，GLUT1和GLUT4蛋白表達升高但無統(tǒng)計學差異；脂代謝相關(guān)基因HSL表達降低(P<0.05)，PPAR-γ表達升高(P<0.05)；細胞因子Visfatin和脂聯(lián)素蛋白表達均下降(P<0.05)；膽固醇代謝相關(guān)基因Insig-2蛋白表達下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：JAZF1基因抑制可減少基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運，增加脂質(zhì)與

6、膽固醇合成，減少脂質(zhì)分解并減少相關(guān)脂肪細胞因子的表達。
　　第三部分 :JAZF1基因抑制對相關(guān)信號通路的影響
　　目的：通過對糖脂代謝相關(guān)信號通路變化的研究，進一步明確JAZF1基因抑制對細胞糖脂代謝的影響機制。
　　方法：運用Western blot技術(shù)檢測兩種細胞糖脂代謝相關(guān)信號通路蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：在肝細胞中，JAZF1抑制條件下的AKT和AMPK的磷酸化差異不明顯，無統(tǒng)計學意義。在脂肪細胞中，