動脈粥樣硬化的新調(diào)控基因——JAZF1和KLF14.pdf

1、第一部分 JAZF1影響膽固醇代謝的分子機制研究
　　目的:探討JAZF1過表達對小鼠體內(nèi)外膽固醇代謝的影響及其可能的分子機制。
　　方法:用RT-qPCR檢測肝組織中JAZF1、HMGCR、LDLR、PPARa、SREBP2、INSIG2和SCAP等膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA的表達;用Western Blot檢測JAZF1、HMGCR和p-CREB的蛋白表達;采用原代細胞培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建JAZF1過表達細胞模型;雙熒光

2、素酶報告系統(tǒng)分析JAZF1調(diào)節(jié)HMGCR轉(zhuǎn)錄活性及結(jié)合位點;化學(xué)比色法檢測細胞內(nèi)膽固醇及相關(guān)脂質(zhì)指標(biāo)水平變化。
　　結(jié)果:Ad-JAZF1感染使C57BL/6J小鼠肝臟內(nèi)JAZF1 mRNA升高約51％，蛋白表達升高約60％。感染使高脂喂養(yǎng)的ApoE KO小鼠肝臟中JAZF1 mRNA水平升高37％、蛋白質(zhì)水平升高近60％; TAK1蛋白水平下降50％; HMGCR的mRNA水平下降80％左右，蛋白降低約50％。Ad-JAZF1轉(zhuǎn)

3、染使原代培養(yǎng)肝細胞中JAZF1的mRNA水平升高近50倍、蛋白升高3倍左右、TC下降27％，HMGCR mRNA和蛋白水平分別下降51％和47％。pGL3-CRE與Ad-JAZF1同時處理使原代肝細胞中熒光素酶活性下降54％，而pGL3-muCRE與Ad-JAZF1同時處理時與對照組相比熒光素酶活性無差異。JAZF1過表達引起CREB在Ser133位點磷酸化水平下降26％。
　　結(jié)論:JAZF1過表達能抑制TAK1、HMGCR的表

4、達、降低血漿膽固醇、肝臟組織和原代肝細胞中總膽固醇水平;抑制CREB在Ser133位點磷酸化水平;經(jīng)CREB途徑抑制HMGCR活性和膽固醇的從頭合成作用。
　　第二部分 KLF14在動脈粥樣硬化中的作用研究
　　目的:通過改變KLF14在體內(nèi)外的表達，探討其對脂質(zhì)代謝及動脈粥樣硬化的影響，并研究其發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機制。
　　方法:用基因重組技術(shù)構(gòu)建KLF14過表達質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-KLF14)、干擾質(zhì)粒

5、（pGenesil-shKLF14）和干擾腺病毒(pAd-shKLF14);用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建巨噬細胞KLF14過表達和抑制表達模型;Ac-LDL誘導(dǎo)形成小鼠巨噬細胞源性泡沫細胞;MTT法檢測細胞活力;用3H-cholesterol標(biāo)記巨噬細胞，液體閃爍計數(shù)法(LSC)測定細胞膽固醇流出率;RT-qPCR測定KLF14、ABCA1、IL-6、TNFα、MCP-1的mRNA表達水平;Western Blots測定KLF14、ABCA1、p-

6、TAK1/t-TAK1、p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表達水平;用SB203580、PD098059、SP600125分別抑制p38、ERK1/2、JNK的蛋白磷酸化水平，并檢測KLF14表達改變對MAPK信號通路和炎癥因子表達的影響。24只雄性ApoE-/-小鼠，鼠齡7周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為高脂喂養(yǎng)+PBS組（HF-A組，n=8）、高脂+pAd-GFP組(GFP-A組，n=8)和高脂+pAd-s

7、hKLF14組（shK-A組，n=8），均喂養(yǎng)12周，于高脂喂養(yǎng)第8周末和第10周末分別給予尾靜脈注射PBS、pAd-GFP和pAd-shKLF14;油紅O染色觀察小鼠主動脈竇及大體的粥樣斑塊形成情況;用酶法測定細胞及血漿中膽固醇濃度。
　　結(jié)果:KLF14在高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J、普食喂養(yǎng)apoE KO小鼠及高脂喂養(yǎng)apoE KO小鼠體內(nèi)mRNA和蛋白表達水平均比正常飲食小鼠升高;未添加Ac-LDL處理時，KLF14過表達使

8、RAW264.7細胞內(nèi)TC水平升高約16％、CE升高25％、CE/TC升高7％，抑制表達降低TC約9％、CE約20％、CE/TC約13％;在添加Ac-LDL處理后，KLF14過表達使RAW264.7細胞內(nèi)TC水平升高27％、CE升高36％、CE/TC升高7％;抑制表達降低TC約16％、CE約32％、CE/TC約19％。KLF14過表達增加了p38、ERK1/2的蛋白磷酸化水平，而JNK磷酸化水平無顯著性差異。KLF14過表達使小鼠巨噬細

9、胞內(nèi)炎癥因子IL-6、TNFα和MCP-1的mRNA表達與對照組分別增加了68％、120％和238％。用化學(xué)抑制劑抑制p-p38、p-ERK1/2后，在RAW264.7細胞中過表達KLF14不能使炎癥因子表達水平升高，而抑制p-JNK后KLF14過表達的作用不明顯;而抑制KLF14表達后上述作用呈現(xiàn)相反趨勢。過表達KLF14能顯著降低ABCA1的mRNA和蛋白表達水平分別達69％和65％，降低細胞膽固醇流出率達63％。在高脂喂養(yǎng)的apo

10、E KO小鼠體內(nèi)，pAd-shKLF14使肝臟中KLF14表達下降50％、主動脈中中性脂質(zhì)的含量及主動脈竇中粥樣斑塊的面積減少，并顯著降低血液中TC水平，LDL、TG有下降趨勢，而HDL有升高趨勢。
　　結(jié)論:KLF14在高脂喂養(yǎng)和動脈粥樣硬化高風(fēng)險的小鼠肝臟內(nèi)有高表達;在小鼠巨噬細胞中過表達KLF14能誘導(dǎo)細胞泡沫化、增加胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯含量，經(jīng)p38、ERK1/2途徑促進炎癥反應(yīng)和炎癥因子IL-6、TNFα和MCP-1的釋