動(dòng)力相關(guān)蛋白1在膿毒癥心肌損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，膿毒癥的全球發(fā)病率很高。嚴(yán)重膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的心功能下降，并增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。線粒體功能紊亂是膿毒癥時(shí)引起心肌細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)的損害的主要原因。近年來(lái)研究表明，心臟線粒體分裂融合的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)在維持心臟線粒體正常生理狀態(tài)中具有重大的作用。而大量研究表明，在心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭、高血壓、糖尿病心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中，線粒體分裂融合的動(dòng)態(tài)平衡

2、紊亂起了至關(guān)重要的作用。動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related peptide1，Drp1)是參與線粒體分裂過(guò)程中的一種關(guān)鍵蛋白。Drp1是否參與了膿毒癥心肌損傷作用尚不明了。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)將從整體和細(xì)胞水平入手研究膿毒癥時(shí)Drp1在心肌損傷中的作用和作用機(jī)制;并探討在膿毒癥時(shí)，IL-6和TNF-α哪個(gè)是導(dǎo)致Drp1改變的主要炎癥因子。
　　方法：
　　1) SD大鼠腹腔注射LPS建立膿毒癥模型，測(cè)定大鼠生

3、存率。
　　2)心臟超聲檢查測(cè)定大鼠心功能。
　　3)提取心肌組織總蛋白和線粒體蛋白，測(cè)定各組分中Drp1、Drp1 S637、Drp1 S616、CaMKⅡ、p-JNK、Rac1/Cdc42、RhoA蛋白水平。
　　4) ELISA法測(cè)定大鼠血清中炎癥因子（LPS、TNF-α、IL-6）濃度。
　　5)透射電鏡觀察大鼠心臟線粒體形態(tài)。
　　6)激光共聚焦顯微技術(shù)觀察心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)。
　　結(jié)果：<

4、br>　　1) SD大鼠腹腔注射不同濃度LPS（5、10、20mg/kg）后，每搏輸出量和心輸出量開始下降;線粒體片段化程度增加。
　　2)SD大鼠給予不同濃度LPS(5、10、20mg/kg)腹腔注射后6h，心肌組織總Drp1水平無(wú)明顯變化，但線粒體Drp1量隨著LPS濃度的增高明顯增加。提示，膿毒癥心肌組織中Drp1發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)位。
　　3) SD大鼠腹腔注射LPS(20mg/kg)后，大鼠死亡率達(dá)70％;而Drp1的

5、特異性抑制劑Mdivi-1(1mg/kg，i.p.)可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的心肌每搏輸出量和心輸出量的下降，并降低大鼠死亡率。
　　4)不同濃度LPS注射后6h，發(fā)現(xiàn)心肌組織中磷酸化Drp1 S637蛋白水平無(wú)明顯變化，但磷酸化Drp1 S616蛋白水平明顯增加。
　　5)SD大鼠腹腔注射LPS（20mg/kg）后，血清中炎癥因子LPS、TNF-α、IL-6濃度明顯增加。LPS（0.01、0.1或1μg/mL）、TNF-α（5

6、、10或20ng/mL）、IL-6（5、10或20ng/mL）孵育H9C2細(xì)胞48h后，可濃度依賴性降低細(xì)胞的生存率。
　　6)LPS(1μg/mL)、IL-6(20ng/ml)對(duì)H9C2細(xì)胞總Drp1和線粒體drp1水平無(wú)明顯影響。TNF-α(20ng/ml)對(duì)H9C2細(xì)胞Drp1總量無(wú)明顯影響，但TNF-α孵育細(xì)胞后，Drp1 Ser616位點(diǎn)的磷酸化和線粒體Drp1水平明顯增加。
　　7)TNF-α（20ng/ml）處

7、理H9C2細(xì)胞后，可明顯增加CaMKⅡ的表達(dá)。但CaMKⅡ的抑制劑KN-93不能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的Drp1的磷酸化和線粒體轉(zhuǎn)位，同時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡也沒(méi)有明顯影響。
　　8)TNF-α（20ng/ml）處理H9C2細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞p-JNK、Rac1/Cdc42無(wú)明顯影響，但RhoA蛋白表達(dá)明顯增加。ROCK1和ROCK2的特異性抑制劑Y-27632和Fasudil可明顯抑制TNF-α的Drp1的磷酸化和線粒體轉(zhuǎn)