膿毒癥大鼠小腸屏障功能損傷和藥物干預(yù)及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、一　研究背景與目的: 膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)。膿毒癥可以最終導(dǎo)致免疫功能的缺陷和多器官功能衰竭。近年來，胃腸道已經(jīng)被認(rèn)識(shí)到在膿毒癥中的重要性。雖然以前胃腸道只是被認(rèn)為在膿毒癥發(fā)展過程中起很小的作用，但是現(xiàn)在認(rèn)為胃腸道在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到很重要的作用，特別是對(duì)于高代謝狀態(tài)的維持。這是因?yàn)樵谀摱景Y中胃腸道結(jié)構(gòu)和功能的改變促使腸道屏障功能的缺失。小腸屏障包括免疫屏障和非免疫屏障。免疫屏障分為局部(腸系膜淋巴結(jié)，MLN

2、s；腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞， IELs)和系統(tǒng)部分(循環(huán)系統(tǒng)淋巴細(xì)胞和脾內(nèi)的淋巴細(xì)胞)。非免疫屏障分為物理屏障(健康的腸上皮細(xì)胞和緊密連接)，化學(xué)屏障和微生物屏障。 小腸物理屏障的代表是小腸上皮。生理狀態(tài)下，小腸上皮的結(jié)構(gòu)和緊密連接只允許非常小的分子的通過，阻止細(xì)菌或者是大分子如，脂多糖的轉(zhuǎn)移。正常狀態(tài)下的小腸，吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)阻止細(xì)菌移位。膿毒癥時(shí)，小腸的通透性改變，細(xì)菌過度牛長(zhǎng)，毒素產(chǎn)生增多，小腸不能阻止細(xì)菌浸潤(rùn)到腸系膜淋巴結(jié)和其他腸

3、外器官(如，脾，肺，肝，血液)。這個(gè)過程稱作細(xì)菌移位。增多細(xì)菌通過小腸上皮細(xì)胞層的穿細(xì)胞途徑和細(xì)胞間途徑的轉(zhuǎn)移，已經(jīng)被認(rèn)為是對(duì)小腸粘膜的直接和間接損傷的表現(xiàn)。細(xì)胞間途徑的細(xì)菌移位可以由腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變引起，特別是緊密連接的改變。在人體內(nèi)，如果只有通過腸腔移位到身體其他部位的細(xì)菌是不足夠產(chǎn)生有害的作用的，移位細(xì)菌的存活才是必不可少的一個(gè)因素。宿主的免疫反應(yīng)才是致病的重要因素。由于機(jī)體處于一種免疫抑制狀態(tài)，膿毒癥病人不能對(duì)于侵入的病原

4、體產(chǎn)生足夠的免疫反應(yīng)。這種免疫抑制表現(xiàn)為脾和外周血T淋巴細(xì)胞增值減少。腸道的免疫系統(tǒng)含有全身大部分的免疫細(xì)胞，被認(rèn)為是對(duì)于維持腸道的功能和粘膜的完整具有極其重要的作用。小腸的T淋巴細(xì)胞將近占全身T淋巴細(xì)胞總數(shù)的60％。T淋巴細(xì)胞增值抑制目前是膿毒癥發(fā)生時(shí)的一個(gè)普遍發(fā)現(xiàn)，這種抑制可以發(fā)生在細(xì)菌移位道腸系膜淋巴結(jié)、脾和循環(huán)系統(tǒng)中。除了T淋巴細(xì)胞的增值抑制，T淋巴細(xì)胞提呈抗原肽給小腸和腸系膜淋巴結(jié)中的B和T細(xì)胞，被抗原提呈細(xì)胞刺激后，可以引發(fā)

5、Th1免疫反應(yīng)。Th1免疫反應(yīng)主要分泌IFN-γ，可以激活巨噬細(xì)胞。與此同時(shí)，T淋巴細(xì)胞可以分泌I L-4，此成為Th2免疫反應(yīng)，Th2免疫反應(yīng)抑制Th1免疫反應(yīng)。在膿毒癥中，這利，Th1/Th2的平衡和其他的控制機(jī)制有可能被破壞了，以致于產(chǎn)生不正常的炎癥反應(yīng)。膿毒癥中細(xì)胞免疫的損害作用于腸道上皮組織，進(jìn)一步的損傷屏障的功能增加腸道的通透性。這種方式下，一個(gè)惡性循環(huán)就產(chǎn)生了，屏障功能的損傷進(jìn)一步的腸道通透性增加，因此引發(fā)免疫反應(yīng)，而免疫

6、反應(yīng)可以反過來作用于腸道屏障促進(jìn)進(jìn)一步腸粘膜通透性的增加。 膿毒癥中一個(gè)普遍的并發(fā)癥是胃腸道淤滯或者腸梗阻。膿毒癥抑制胃腸運(yùn)動(dòng)。胃腸道中食物的儲(chǔ)留可以引起細(xì)菌過度生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)菌移位和多器官功能衰竭。這說明胃腸道的淤滯可以是膿毒癥的結(jié)果但是也可以引起膿毒癥，尤其是引起膿毒癥的持續(xù)狀態(tài)或者復(fù)發(fā)。微循環(huán)的功能障礙同樣也在膿毒癥的病理生理變化中起到關(guān)鍵的作用，引起組織缺氧和多器官功能障礙。膿毒癥中內(nèi)臟血流灌注不足和血流的重新分布會(huì)導(dǎo)致粘

7、膜的缺氧。因?yàn)樾∧c粘膜絨毛的血管特殊逆流結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)為了保持粘膜功能的完整性對(duì)于氧和營(yíng)養(yǎng)成份有廣大的需要量，小腸粘膜對(duì)于灌注不足尤其易使粘膜受損。跟著發(fā)生腸道的缺血，因?yàn)檎衬て琳系膿p傷，引起細(xì)菌和毒素的移位導(dǎo)致膿毒癥的狀態(tài)的維持和成為膿毒癥的始動(dòng)器官。宿主防御細(xì)菌攻擊的過程中，肥大細(xì)胞由于集中在特殊的位置，如粘膜表面，它的重要作用不容忽視。正常人腸道粘膜肥大細(xì)胞占有全身將近2％-3％的數(shù)量。肥大細(xì)胞可以攝入和清除諸如大腸桿菌類的抗原。

8、細(xì)菌引起肥大細(xì)胞的脫顆粒。幽門螺旋桿菌感染時(shí)，在胃組織中可以觀察到豐富的肥大細(xì)胞。因此，腸道肥大細(xì)胞活化在某種程度上屬于生理反應(yīng)但是可能對(duì)于宿主并不一直是恰當(dāng)?shù)幕蛘哂幸娴?。最近，在膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在細(xì)菌感染的過程中被認(rèn)為是有害的因素。另有研究者認(rèn)為肥大細(xì)胞的二肽基肽酶I(D P P I)可以使膿毒癥模型動(dòng)物的死亡率升高。在腸道中，肥大細(xì)胞通過釋放脂類介質(zhì)和炎癥因予，目前被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)腸道的功能，包括調(diào)節(jié)上皮屏障(物理屏障)，運(yùn)動(dòng)

9、和內(nèi)臟的敏感性。一氧化氮和大鼠肥大細(xì)胞蛋白酶Ⅱ(R M C P Ⅱ)被認(rèn)為是與胃腸道有關(guān)的重要的肥大細(xì)胞的介質(zhì)。 由于小腸對(duì)于膿毒癥發(fā)生和發(fā)展起到非常重要的作用，所以小腸就目前成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。丙酮酸乙脂(e t h y l p y r u v a t e， E P)，一種穩(wěn)定的丙酮酸鹽衍生物，是一種實(shí)驗(yàn)性治療藥物。丙酮酸乙脂已經(jīng)被證實(shí)可以改善腸系膜缺血再灌注，出血性休克，內(nèi)毒素血癥和細(xì)菌性膿毒癥動(dòng)物模型中的腸道，腎臟和肝臟

10、的損傷。用丙酮酸乙脂治療也可以改善在急性胰腺炎和酒精性肝炎小鼠模型中的器官功能損傷。在很多急性危重病模型中，用丙酮酸乙脂治療可以下調(diào)不同的促炎基因的表達(dá)，包括i NOS，TNF-α，COX-2和I L-6。烏司他丁(u linastatin，UTI)是從人的尿液中分離出來的分予量為 2 4，000 O D a的糖蛋白。烏司他丁具有抗炎的作用和抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放的作用。近年來的研究表明烏司他丁在缺血再灌注的肝

11、臟、腎臟、心臟和肺臟的損傷中具有細(xì)胞保護(hù)作用。而且，烏司他丁還可以抑制脂多糖(L P S)刺激的人類單核細(xì)胞分泌的T N F-α，抑制脂多糖刺激的白介素(I L-8)基因在H L 6 0細(xì)胞中的表達(dá)。 丙酮酸乙脂和烏司他丁在膿毒癥中對(duì)于小腸屏障(物理和免疫屏障)、運(yùn)動(dòng)功能利小腸粘膜微循環(huán)的作用及其作用機(jī)制很少有系統(tǒng)的研究。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的膿毒癥模型，觀察小腸屏障功能、運(yùn)動(dòng)功能和微循環(huán)的損傷以及丙酮酸乙脂和烏司

12、他丁對(duì)他們的保護(hù)作用的研究。 二研究對(duì)象和方法:1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：健康雄性成年w i s t a r大鼠1 2 0只，體重2 5 0 g±1 2.7 g，.由山東大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，標(biāo)準(zhǔn)飼料，專人單籠飼養(yǎng)大鼠，明暗周期為1 2小時(shí)，飼養(yǎng)1周。試驗(yàn)前1 2小時(shí)禁食，自由飲水。由于膿毒癥模型的高死亡率，隨機(jī)分配膿毒癥組(C L P)3 5只，丙酮酸乙脂組(E P)3 5只，烏司他丁組(U T I)3 5只，假手術(shù)組(s h am)

13、1 5只。E P手術(shù)后6小時(shí)腹腔給藥，每6小時(shí)給一次，每次1 2 0 m g/k g。U T I于手術(shù)后6小時(shí)腹腔給藥，5 0，0 0 0 U/k g/d℃ L P組與s h am組動(dòng)物每次給予1.2 m L林格氏液。 動(dòng)物模型制備及標(biāo)本收集：手術(shù)前12小時(shí)禁食不禁水，手術(shù)前腹腔注射1％戊巴比妥鈉(5 0 m g/kg)麻醉，取仰臥位，7 5％酒精消毒腹部后鋪洞巾，沿腹正中線做一長(zhǎng)約1.5 cm的切口，剪開皮膚和肌層，探查腹腔找

14、到盲腸，避免損傷腸系膜血管。用4號(hào)絲線結(jié)扎盲腸末端1/3，用23號(hào)針穿刺兩次形成2個(gè)盲腸漏，然后輕輕擠出少許糞便。將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。Sham組給予相同的手術(shù)只是沒有盲腸結(jié)扎穿孔過程。動(dòng)物術(shù)后皮下注射生理鹽水2-3 ml/kg，分籠喂養(yǎng)，觀察大鼠一般情況及4天的生存率。術(shù)后每天從動(dòng)物頸靜脈取血1m L，1500 r/mi n離心15分鐘，取上清-20℃保存。術(shù)后4天，每一組存活的大鼠被活殺，心臟穿刺取血，1500 r/mi

15、 n離心15分鐘，取上清-20℃保存。打開腹腔后，無菌取腸系膜淋巴結(jié)(MLN)和脾放入含有冰PBS(pH 7.4)的培養(yǎng)皿。分離小腸，距回盲部5 cm取回腸，用冰鹽水灌注清除小腸內(nèi)容物，待檢。 2 實(shí)驗(yàn)方法(1)各組生存率分析。 (2)光學(xué)顯微鏡觀察HE小腸切片：每只動(dòng)物小腸切片中，任意選取2 0個(gè)光鏡視野，小腸組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化根據(jù)0zkan標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。①正常小腸粘膜；②小腸粘膜水腫變性，上皮細(xì)胞表面與固有層分離；③上皮細(xì)胞的壞

16、死，局限在絨毛尖端。④完全的絨毛壞死；⑤粘膜全層的壞死。 結(jié)論：及意義:1 本實(shí)驗(yàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥大鼠模型，觀察到在膿毒癥大鼠中，小腸的物理屏障和免疫屏障、小腸的運(yùn)動(dòng)和小腸粘膜微循環(huán)均有損傷，小腸組織中的肥大細(xì)胞發(fā)生活化，及血液中和小腸組織中NO濃度，小腸組織中M PO活性和iNOS mRNA表達(dá)增高。 2.丙酮酸乙脂和烏司他丁治療干預(yù)均發(fā)現(xiàn)對(duì)于膿毒癥大鼠小腸的保護(hù)作用，表現(xiàn)為小腸的屏障功能都得到了改善

17、，但是這兩種藥物的作用機(jī)制卻不完全相同。 (1)丙酮酸乙脂減少膿毒癥大鼠細(xì)菌移位的發(fā)生，提高牛存率。保護(hù)小腸的物理屏障和免疫屏障，尤其是免疫屏障，不僅增加CD4+T淋巴細(xì)胞在腸系膜淋巴結(jié)和小腸組織中的數(shù)量，還可以維持Th1/Th2細(xì)胞因子分泌的平衡。并可以抑制血液和小腸組織中NO水平的升高，抑制小腸組織中MPO活性和iNOS mRNA的表達(dá)，改善小腸運(yùn)動(dòng)和小腸粘膜的血流，但不能抑制小腸粘膜肥大細(xì)胞的活化。 (2)烏司他丁