中樞干預α7煙堿乙酰膽堿受體對膿毒癥大鼠預后和T細胞免疫功能的影響及其機制.pdf

1、膿毒癥損傷涉及炎癥、免疫等病理生理過程。膿毒癥狀態(tài)下重要器官（肺、心臟、肝臟以及腎臟）發(fā)生炎癥改變，充血水腫，造成急性器官功能受損。膿毒癥時T淋巴細胞免疫功能持續(xù)處于抑制狀態(tài)，有研究表明膿毒癥時IL-2的水平一直處于較低水平，IL-2作為T淋巴細胞的重要生長因子，其產(chǎn)生減少可誘導大量T淋巴細胞凋亡，數(shù)量減少;此外，出現(xiàn)了傾向于輔助性T細胞(Th)2型的免疫反應(yīng)，Th2分泌的抗炎細胞因子IL-4增多，而Th1分泌的IL-2和IFN-γ等促

2、炎細胞因子減少，明顯損害了機體的細胞免疫功能。
　　α7型煙堿乙酰膽堿受體(α7nAChR)是膽堿能抗炎通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)的關(guān)鍵受體，α7nAChR是目前研究最多的膽堿能受體，其廣泛表達于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。越來越多的研究證明，α7nAChR不僅表達于神經(jīng)元細胞，而且還表達于一些免疫細胞，例如巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞(DC)、T和B淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞以及腸和肺上皮細胞。體內(nèi)外實驗研究證實，激動α7nAChR可以控制許

3、多抗炎細胞因子的表達，減輕膿毒癥動物模型的臨床表現(xiàn)（包括嗜睡、腹瀉）和防止內(nèi)毒素(LPS)誘導的體溫過低和血細胞比容減少，提高膿毒癥動物的存活率。而抑制α7nAChR則導致膿毒癥向更嚴重的方向發(fā)展。但上述結(jié)論主要基于體外實驗或從外周干預的體內(nèi)動物實驗而得出，關(guān)于中樞途徑干預對膿毒癥動物模型的預后及T淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)功能的潛在影響尚不清楚。
　　本實驗觀察中樞途徑干預對膿毒癥動物生存率的影響，并采用CCK法檢測不同處理方法后CD4+

4、T細胞增殖活性改變，應(yīng)用ELISA及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等技術(shù)從蛋白和基因水平檢測細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的表達，以充分了解T細胞免疫功能的變化及其意義。
　　研究目的:
　　1.觀察中樞干預α7nAChR對嚴重膿毒癥大鼠生存率、脾臟T淋巴細胞功能的影響;
　　2.觀察電刺激或離斷迷走神經(jīng)對嚴重膿毒癥大鼠脾臟T淋巴細胞功能變化的影響;
　　3.觀察中樞干預HMGB1對嚴重膿毒癥大鼠生存

5、率及脾臟T淋巴細胞功能的影響。
　　研究方法:
　　1.采用免疫磁珠法分離正常SD大鼠脾臟CD4+T細胞，流式細胞術(shù)鑒定CD4+T細胞純度。
　　2.采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復制膿毒癥大鼠模型。(1)設(shè)藥物干預組、模型組、假傷組，藥物干預組與模型組均采用CLP法制備膿毒癥大鼠模型，藥物干預組予PNU-282987（0.16μg/μl，5μl）和MLA（2.4 ng/μl，5μl），而模型組和假傷組予相同體積的生理鹽

6、水，分別于術(shù)后0h、6h進行側(cè)腦室注射。分別于術(shù)后12h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h及168 h計數(shù)各小組存活大鼠數(shù)目，采用Kaplan-Merer法進行生存率分析。(2)雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)（SHAM）組、CLP+NS組、CLP+α7nAchR激動劑(PNU)0.25μg組、CLP+PNU0.8μg組和CLP+PNU2.56μg組。行CLP后分別通過中樞注入5μl生理鹽水(NS)和5

7、μl PNU-282987（0.05μg/μl、0.16μg/μl和0.512μg/μlPNU-282987），所有動物于造模成功后24 h脫勁處死，提取脾臟CD4+T細胞。(3)雄性SD大鼠被隨機分為SHAM組、CLP+NS組、CLP+α7nAchR抑制劑(MLA)6 ng組、CLP+MLA12 ng組和CLP+MLA24 ng組，所有動物于造模成功后24 h脫勁處死，提取脾臟T細胞。(4)雄性SD大鼠被隨機分為SHAM組、CLP+N

8、S組、CLP+PNU0.8μg組和CLP+MLA12 ng組，所有動物于造模成功后分別于24 h、48 h、72 h脫勁處死，提取脾臟CD4+T細胞。(5)雄性SD大鼠被隨機分為SHAM、CLP+NS組、CLP+A-Box（HMGB1拮抗劑）1μg組和CLP+A-Box10μg組，所有動物于造模成功24 h之后脫勁處死，提取脾臟CD4+T細胞。(6)雄性SD大鼠被隨機分為SHAM組、CLP+迷走神經(jīng)電刺激組(VNS)和CLP+迷走神經(jīng)離

9、斷組(VGX)，所有動物于造模成功后分別于24 h、48 h、72 h脫勁處死;提取脾臟CD4+T細胞。
　　3.純化的CD4+T細胞用含刀豆素A的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1106/ml(5排重復孔，每排末設(shè)調(diào)零孔)，加入96孔板中，每孔200μl。每孔刀豆素A的濃度為5μg/μl。96孔板其余各孑孔中分別加入消毒的PBS200μl（保濕），置細胞培養(yǎng)箱68 h。每孔各收集100μl上清裝入EP管中(ELISA檢測細胞因子IL-2、I

10、L-4和IFN-γ)。再加入CCK-8每孔10μl，輕輕震蕩后置細胞培養(yǎng)箱2h后，采用酶標儀450 nm測吸光度(OD)值。此外，采用Trizol法提取CD4+T細胞總RNA，進行RT-PCR分析，β-actin作為內(nèi)參照。從基因水平檢測IL-2、IL-4和IFN-γ表達水平。
　　4.統(tǒng)計學方法:采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用(x)±s表示，單因素多組數(shù)據(jù)進行方差分析(One-Way ANOVA)，倆樣本

11、間比較采用t檢驗。生存率使用Kaplan-Merer法做統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.正常大鼠脾臟單個核細胞經(jīng)過MACS兩次分選后，通過流式細胞儀檢測獲得CD4+T細胞純度可達90％。CD4+T細胞經(jīng)過臺盼藍染后檢測，其活性大干98％。
　　2.側(cè)腦室注射PNU和MLA對膿毒癥大鼠存活率及脾臟T淋巴細胞功能的影響:①假傷組動物存活率為100％。與假傷組比較，CLP組存活率顯著降低

12、(P＜0.05)，PNU處理組存活率較CLP組升高(P＜0.05)，而MLA處理組存活率與CLP組相比無顯著意義(P＞0.05);②CLP術(shù)后T淋巴細胞增殖能力顯著下降(P＜0.01)，IL-2、FN-γ表達水平降低,IL-4表達增強(P＜0.05)。而PNU處理組T淋巴細胞增殖活性升高(P＜0.01)，IL-2、IFN-γ水平增高，IL-4表達則明顯降低(P＜0.05);且PNU0.8μg組T淋巴細胞增殖能力較PNU0.25μg組和P

13、NU2.56μg組更為顯著（P＜0.01）。側(cè)腦室注射MLA后T淋巴細胞增殖能力均降低(P＜0.01)，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4表達增強(P＜0.05)，不同劑量之間無顯著性差異(P＞0.05)。③PNU、MLA處理后分別于24 h、48 h、72 h觀察T淋巴細胞免疫功能，PNU組24 h、48 h、72 h較CLP組T淋巴細胞增殖能力均升高，IL-2、IFN-γ水平上升，IL-4水平下降(P＜0.05);而MLA處理組

14、24 h、48 h、72 h較CLP組T淋巴細胞增殖能力均明顯下降，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4表達則顯著增強(P＜0.05)。
　　3.切斷和電刺激迷走神經(jīng)對嚴重膿毒癥大鼠脾臟T淋巴細胞功能的影響:與假傷組比較，CLP組T淋巴細胞增殖能力水平顯著下降(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ水平降低，而IL-4水平升高(P＜0.05)。與CLP組比較，VGX組T淋巴細胞增殖能力顯著下降(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ

15、水平降低，IL-4水平增加(P＜0.05);而VNS組T淋巴細胞增殖能力顯著增強(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ分泌量顯著增多，IL-4分泌量顯著減少(P＜0.05)。
　　4.側(cè)腦室注射HMGB1拮抗劑(A-Box)對膿毒癥大鼠的存活率及脾臟T淋巴細胞功能的影響:①假傷組動物存活率為100％。與假傷組比較，CLP組存活率顯著降低(P＜0.05)，A-Box1μg處理組存活率與CLP組相比無顯著差異(P＞0.05)，而A-B

16、ox10μg處理組存活率較CLP組顯著升高(P＜0.05);②CLP術(shù)后T淋巴細胞增殖能力顯著下降(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ表達水平降低，IL-4水平升高(P＜0.05)。A-Box處理組T淋巴細胞增殖活性顯著升高(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ水平升高，IL-4水平則降低(P＜0.05)，其中以高劑量組影響尤為顯著。
　　研究結(jié)論:
　　1.中樞給予α7煙堿乙酰膽堿受體激動劑可有效提高膿毒癥大鼠的生存率，