煙堿型乙酰膽堿受體異質(zhì)化在膿毒癥致骨骼肌對(duì)非去極化肌松劑敏感性下降中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究不同病程階段的膿毒癥對(duì)非去極化肌松劑（Non-depolarizing neuromuscular block agents，NMBA）量效及時(shí)效的影響;從神經(jīng)肌接頭（neuromuscular junction，NMJ）突觸后膜煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)的異質(zhì)化探討膿毒癥導(dǎo)致NMBA藥理學(xué)變化的機(jī)制;驗(yàn)證蛋白酶抑制劑烏司他丁改善NMBA藥效作用的有效性以

2、及對(duì)NMJ突觸后nAChR異質(zhì)化的作用。
　　方法：
　　第一部分：
　　選擇健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠66只，鼠齡2～3月，體重200～220 g，隨機(jī)分為正常組（Normal組，n=6）、假手術(shù)組（Sham組，n=6）以及膿毒癥組（Sepsis組）。Normal組大鼠不予任何處理。Sham組大鼠僅行開腹盲腸探查，不予盲腸結(jié)扎。Sepsis組大鼠通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal ligatio

3、n and puncture，CLP)構(gòu)建膿毒癥模型。在建模（Sepsis組）或手術(shù)（Sham組）后第1天（Day1組，n=6）、第3天（Day3組，n=6）、第7天（Day7組，Sham組中n=6，Sepsis組中n=12）以及第14天（Day14組，Sham組n=6，Sepsis組n=12）進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)和標(biāo)本采集。按劑量累計(jì)法給予非去極化肌松劑維庫(kù)溴銨(初始劑量為0.05 mg/kg，以0.1 mg/kg為遞增劑量，最大劑量達(dá)到1

4、mg/kg)。以0.1Hz頻率刺激坐骨神經(jīng)，檢測(cè)單次肌顫搐收縮力，計(jì)算維庫(kù)溴銨的最大單次肌顫搐抑制百分率(％)，以相應(yīng)劑量擬合量效曲線。通過(guò)軟件得到維庫(kù)溴銨的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)和95％有效抑制濃度(IC95)。最后單次給予2×1C95的維庫(kù)溴銨，記錄藥物起效時(shí)間、維持時(shí)間以及恢復(fù)時(shí)間。
　　第二部分：
　　選擇健康成年雄性SD大鼠60只，鼠齡2～3月，體重200～220 g，隨機(jī)分為Sham組以及Sepsis組。S

5、epsis組大鼠通過(guò)CLP構(gòu)建膿毒癥模型。Sham組大鼠僅行開腹盲腸探查術(shù)，不予盲腸結(jié)扎。各組分別在建模后1天（Day1組，n=6）、3天（Day3組，n=6）、7天（Day7組，Sham組中n=6，Sepsis組中n=12）以及14天（Day7組，Sham組中n=6，Sepsis組中n=12）進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)和標(biāo)本采集。各組大鼠分別在建?；蚴中g(shù)前、后檢測(cè)脛前肌復(fù)合肌動(dòng)作電位(Compound muscle actionpotential，

6、CMAP)，測(cè)定其波幅和時(shí)程，計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(Motornerve conduction velocity，MCV)，同時(shí)測(cè)定單次肌顫搐收縮力。取大鼠脛前肌組織，運(yùn)用免疫組化和免疫熒光法測(cè)定γ-nAChR和α7-nAChR在骨骼肌細(xì)胞膜上的表達(dá)和分布;通過(guò)western-blot測(cè)定這兩種蛋白表達(dá)量;采用RT-PCR法測(cè)定γ和α7功能亞基mRNA的表達(dá)水平;取L4～L5節(jié)段脊髓前角神經(jīng)組織，通過(guò)western-blot測(cè)定neur

7、egulin-1蛋白表達(dá)量。
　　第三部分：
　　選擇健康成年雄性SD大鼠24只，鼠齡2～3月，體重200～220 g，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（0.9％N.S組，n=12）和烏司他丁組（Ulinastatin組，n=12）。各組大鼠通過(guò)CLP構(gòu)建膿毒癥模型，在建模后第10天靜脈給予烏司他丁5000 u/kg（Ulinastatin組）或給予等容量0.9％N.S（0.9％N.S組），每天1次，連續(xù)3天。各組大鼠在建模后第14天

8、進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)和標(biāo)本采集。維庫(kù)溴銨藥效學(xué)研究同實(shí)驗(yàn)第一部分方法。神經(jīng)電生理檢測(cè)和蛋白檢測(cè)檢測(cè)同實(shí)驗(yàn)第二部分。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　(1)Sham組各亞組維庫(kù)溴銨IC50與Normal組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Sepsis組中，Day1組維庫(kù)溴銨IC50與Normal組和Sham組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組與Normal組和Sham組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

9、。Sham組各亞組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Sepsis組各亞組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Sepsis組和Sham組在建模/手術(shù)后同一時(shí)間的亞組比較，除Day1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)Normal組與Sham組各亞組的起效時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sham組各亞組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0

10、5）。 Sepsis組中，Day1組維庫(kù)溴銨起效時(shí)間與Normal組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組與Normal組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在建模后同一時(shí)間組比較，Sepsis組的Day1組和Sham組的Day1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余時(shí)間組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　Normal組與Sham組各亞組的維持時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sham組各

11、亞組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Sepsis組中，Day1組維庫(kù)溴銨維持時(shí)間與Normal組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組與Normal組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在建模后同一時(shí)間組比較，Sepsis組和Sham組的維持時(shí)間在Day1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余時(shí)間組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　Normal組與Sham組各亞組的恢復(fù)時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)意義(P＞0.05)。Sham組各亞組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Sepsis組中，Day1組維庫(kù)溴銨恢復(fù)時(shí)間與Normal組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組與Normal組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在建模后同一時(shí)間組比較，Sepsis組和Sham組的恢復(fù)時(shí)間在Day1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余時(shí)間組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　第二部分：
　　

13、(1)Sham組各亞組的CMAP幅值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sepsis組各亞組的CMAP幅值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Day1組幅值最高，Day14組CMAP幅值最低。Sepsis組和Sham組在建模后同一時(shí)間組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　Sham組各亞組的CMAP時(shí)程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sepsis組各亞組的CMAP時(shí)程比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

14、Day14組時(shí)程最長(zhǎng)，Day1組CMAP時(shí)程最短。Sepsis組和Sham組在建模后同一時(shí)間組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　Sham組各亞組的MCV比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Sepsis組各亞組的CMAP幅值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Day1組MCV最高，Day14組MCV最低。Sepsis組和Sham組在建模后同一時(shí)間組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2) Sha

15、m組各亞組的肌顫搐收縮力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sepsis組各亞組的肌顫搐收縮力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Day1組肌顫搐收縮力最高，Day14組肌顫搐收縮力最低。Sepsis組和Sham組在建模后同一時(shí)間組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)與Sham組比較，膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14組的大鼠骨骼肌γ-nAChR蛋白表達(dá)逐漸增高;在膿毒癥建模后14天，γ-nA

16、ChR蛋白表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。γ-nAChR蛋白分布于骨骼肌細(xì)胞膜上。γ-nAChR功能亞基γ亞基mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)與蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)一致。與Sham組比較，膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14的大鼠骨骼肌α7-nAChR蛋白表達(dá)逐漸增高;在膿毒癥建模后14天，α7-nAChR蛋白表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。α7-nAChR功能亞基α7亞基mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)與蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)一

17、致。
　　(4)與Sham組比較，Sepsis組各組的大鼠骨骼肌終板膜增高;膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14組的大鼠骨骼肌終板膜比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著膿毒癥模型建模時(shí)間越長(zhǎng)，終板膜的面積逐漸增加。
　　(5)與Sham組比較，膿毒癥Day1、Day3、Day7以及Day14組的大鼠脊髓背角神經(jīng)元的neuregulin-1蛋白表達(dá)降低;在膿毒癥建模后14天，neuregulin-1蛋白表達(dá)

18、達(dá)到最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著膿毒癥模型建模時(shí)間越長(zhǎng)，neuregulin-1蛋白表達(dá)逐漸降低。
　　第三部分：
　　(1) Ulinastatin組大鼠脛前肌CMAP的幅值和神經(jīng)傳導(dǎo)速度與0.9％N.S組大鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而時(shí)程比較，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(2)Ulinastatin組大鼠脛前肌單次肌顫搐收縮力高于0.9％N.S組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

19、(P＜0.05)。
　　(3)與0.9％N.S組比較，Ulinastatin組大鼠脛前肌γ-nAChR蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同樣，Ulinastatin組大鼠脛前肌γ-nAChR功能亞基γmRNA表達(dá)水平低于0.9％N.S組(P＜0.05)。與0.9％N.S組比較，Ulinastatin組大鼠脛前肌α7-nAChR蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ulinastatin組大鼠脛前肌α7-nA

20、ChR功能亞基α7 mRNA表達(dá)水平低于0.9％N.S組(P＜0.05)。
　　(4)與0.9％N.S組比較，Ulinastatin組大鼠脊髓背角神經(jīng)元neuregulin-1蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)膿毒癥導(dǎo)致骨骼肌對(duì)非去極化肌松劑敏感性下降，表現(xiàn)為肌松作用下降，肌松起效時(shí)間延長(zhǎng)，維持時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間縮短。同時(shí)，膿毒癥導(dǎo)致神經(jīng)肌肉功能障礙，骨骼肌收縮力下降，復(fù)合肌動(dòng)作電位幅

21、值降低，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，發(fā)生脫髓鞘改變;
　　(2)膿毒癥導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞膜上胎兒型乙酰膽堿受體γ-nAChR和神經(jīng)型乙酰膽堿受體α7-nAChR表達(dá)升高，并分布于骨骼肌整個(gè)細(xì)胞膜。膿毒癥的非去極化肌松劑的肌松作用下降與這兩種非成熟型nAChR受體的表達(dá)有關(guān);
　　(3)蛋白酶抑制劑烏司他丁可抑制膿毒癥導(dǎo)致的骨骼肌細(xì)胞膜上γ-nAChR和α7-nAChR的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)神經(jīng)肌肉功能的恢復(fù)，改善骨骼肌對(duì)非去極化肌松劑的敏感性。