腫瘤組織SNP突變分析及其MPS技術(shù)應用初探.pdf

1、目的：腫瘤組織樣本是法醫(yī)檢案中常會遇到的一類特殊的疑難生物檢材，其本身具有基因突變的特性，且大部分都是經(jīng)過福爾馬林固定石蠟包埋保存，極易發(fā)生DNA降解。而法醫(yī)學常規(guī)檢驗的STR在腫瘤組織突變率較高，且擴增片段較長容易發(fā)生等位基因丟失，使得傳統(tǒng)毛細管電泳檢測STR方法已不再適用于腫瘤組織的檢測。與STR相比，SNP突變率較低，擴增片段短。因此，本研究旨在探討腫瘤組織的SNP突變規(guī)律，繼而比較福爾馬林固定的降解腫瘤組織的SNP與STR的檢出

2、率，并初步探索二代測序技術(shù)在檢測腫瘤組織中的應用價值，為法醫(yī)檢案中檢驗腫瘤組織選擇遺傳標記以及檢測技術(shù)提供基礎實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.樣本采集：本實驗中所使用的樣本為本室保存的124例腫瘤組織，包括85例消化道系統(tǒng)、16例泌尿系統(tǒng)、13例呼吸系統(tǒng)、10例頭頸部的腫瘤組織及癌旁正常組織。所用的24例降解樣本是福爾馬林固定、-20℃保存五年的組織提取的DNA，包括12例消化道系統(tǒng)腫瘤組織及其癌旁正常組織。
　　2.

3、DNA提?。河檬灠窠M織DNA提取試劑盒提取上述124例腫瘤組織及正常組織DNA，采用ND-1000蛋白核酸定量儀定量。用GeneReadTM DNA FFPE試劑盒提取24例經(jīng)福爾馬林固定的組織樣本 DNA，采用Quantifiler Trio DNA定量試劑盒在7500實時熒光定量PCR儀上進行定量，得到樣本濃度及降解系數(shù)。
　　3.SNP分型：采用55個SNPs SNaPshot復合分型體系進行SNP分型， ABI3130

4、基因分析儀電泳，使用GeneMapper ID v3.2軟件分析結(jié)果，得到腫瘤組織、正常組織的SNP分型。比對來自同一個體的正常組織和腫瘤組織的SNP分型結(jié)果，記錄突變的位點和突變類型。
　　4.SNP突變位點驗證：采用單位點擴增SNaPshot、Sanger測序方法對突變位點進行驗證。
　　5.STR分型：采用PowerPlex 21試劑盒擴增降解樣本的20個常染色體STR基因座，ABI3130基因分析儀進行電泳，使用Ge

5、neMapper ID v3.2軟件分析結(jié)果，得到24例降解樣本的STR分型。
　　6.STR單個基因座檢測：對疑似突變的STR基因座采用單個STR基因座進行PCR擴增，用聚丙烯酰氨凝膠電泳進行檢測。
　　7.Miseq FGx測序：采用ForenSeqTM DNA Signature Prep試劑盒（DNA引物混合液A）在Miseq FGx測序平臺對24例降解樣本進行測序，包括27個常染色體STR、24個Y-STR、7個X

6、-STR、94個個體識別SNP，用ForenSeqTMUAS V1.2.16347法醫(yī)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　8.統(tǒng)計學分析：應用Excel、SPSS v21.0軟件對上述實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，用χ2檢驗比較消化道腫瘤與其他類型腫瘤之間SNP突變的差異。用直線相關對 STR基因座片段大小與等位基因檢出率、樣本降解系數(shù)與等位基因檢出率進行相關性分析。用均數(shù)和標準差對Miseq FGx測序結(jié)果中STR與SNP的平均測序深度、平均

7、雜合比值、基因座的構(gòu)成比進行統(tǒng)計學描述。用秩和檢驗和t檢驗比較降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本之間STR與SNP測序深度、雜合比值、基因座構(gòu)成比的差異。用直線相關分析方法分析STR和SNP測序深度與片段長度、測序深度與樣本降解系數(shù)的相關性。
　　結(jié)果：
　　1.腫瘤組織的SNP突變分析。85例消化道腫瘤樣本、16例泌尿系統(tǒng)腫瘤樣本、13例呼吸系統(tǒng)腫瘤樣本、10例頭頸部腫瘤樣本經(jīng)SNaPshot復合分型體系分型后，共發(fā)現(xiàn)49個疑

8、似突變位點。之后對49個位點進行了單位點SNaPshot驗證，結(jié)果顯示共3例樣本4個位點發(fā)生了突變，1例消化道腫瘤樣本的（rs9905977：C/T→T，rs722290：C/G→G），2例泌尿系統(tǒng)腫瘤樣本（rs7041158：C/T→C）（rs10092491：C/T→C），均表現(xiàn)為雜合性丟失。對四個位點進行Sanger測序驗證，1例泌尿系統(tǒng)腫瘤樣本rs7041158測序失敗，其余三個位點測序成功，均表現(xiàn)為雜合性丟失，與單位點SNaP

9、shot驗證結(jié)果一致。用χ2檢驗對消化道腫瘤與其他類型腫瘤的SNP突變率差異進行比較分析，無統(tǒng)計學差異。對腫瘤組織 SNP突變率與本實驗室前期檢測的STR突變率進行比較，在樣本與基因座水平 SNP突變率均明顯低于STR突變率，具有統(tǒng)計學差異。
　　2.降解組織SNP與STR檢出率比較。采用Quantifiler Trio DNA定量試劑盒在7500實時熒光定量PCR儀上對24例福爾馬林固定存放五年的組織樣本 DNA的降解系數(shù)及濃度

10、進行檢測。檢測結(jié)果顯示，除1例樣本的降解系數(shù)小于1外，其余23例樣本降解系數(shù)范圍為1.01~8.57，發(fā)生不同程度的降解。此24例存放五年的組織樣本與其在福爾馬林固定24小時內(nèi)提取的DNA檢測結(jié)果相比，SNP分型完全一致，檢出率為100％；而STR檢測結(jié)果顯示共發(fā)生13個基因座等位基因完全丟失，7個基因座發(fā)生等位基因雜合性丟失，這些發(fā)生等位基因丟失的樣本大部分降解較嚴重，降解系數(shù)大于2.6，且75.8%丟失等位基因的片段長度大于300b

11、p。對STR基因座片段長度與等位基因檢出率之間進行相關性分析，呈負相關，隨著檢測片段長度增長，STR基因座檢出率逐漸下降。除兩例樣本降解系數(shù)較小卻發(fā)生等位基因丟失外，其余樣本降解系數(shù)與等位基因檢出率之間呈負相關，即DNA樣本降解系數(shù)越大，STR等位基因檢出率越低。
　　3.Miseq FGx測序結(jié)果分析。12例降解的腫瘤樣本STR基因座（Amel除外）平均測序深度為2384×（±1884×），平均雜合比值為0.61（±0.13），

12、等位基因所占比例為0.92（0.81~1.00），stutter所占比例為0.06（0.00~0.13），noise所占比例為0.02（0.00~0.07）。12例降解的正常樣本STR基因座（Amel除外）平均測序深度為2158×（±1710×），平均雜合比值0.73（±0.11），等位基因所占比例為0.92（0.81~1.00），stutter所占比例為0.06（0.00~0.13），noise所占比例為0.02（0.00~0.07）

13、。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本在STR基因座平均測序深度、等位基因、stutter、noise所占比例均無統(tǒng)計學差異，而正常樣本的基因座平均雜合比值高于腫瘤樣本，具有統(tǒng)計學差異。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本STR基因座平均測序深度與基因座片段長度之間呈負相關，即隨著基因座片段長度增加， STR基因座平均測序深度降低。降解的腫瘤樣本樣本STR測序深度與樣本降解系數(shù)之間無相關性，降解正常樣本樣本 STR測序深度與樣本降解系數(shù)之間呈負相關

14、。
　　12例降解的腫瘤樣本SNP位點平均測序深度741×（±661×），平均雜合比值0.61（±0.12），等位基因所占比例為0.9998（0.9925~1.0000）， noise所占比例為0.0002（0.0000~0.0075）。12例降解的正常樣本SNP位點平均測序深度633×（±552×），平均雜合比值0.77（±0.12），等位基因所占比例為0.9995（0.9892~1.0000）， noise所占比例為0.000

15、5（0.0000~0.0108）。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本SNP位點平均測序深度無統(tǒng)計學差異。SNP位點平均雜合比值、SNP位點等位基因、noise所占比例均有統(tǒng)計學差異。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本SNP位點平均測序深度與SNP位點片段長度之間呈負相關，即隨著SNP位點片段長度增加，SNP位點平均測序深度降低。樣本SNP測序深度與樣本降解系數(shù)之間無相關性。
　　24例降解樣本在Miseq測序平臺與CE平臺檢測的Power

16、Plex 21試劑盒進行STR一致性研究。結(jié)果顯示除16例樣本共24個基因座分型結(jié)果不一致外，其余基因座檢測結(jié)果一致。有21個基因座檢測出基因亞型，3個基因座比CE多檢測出一個新的等位基因。針對降解DNA，Miseq測序平臺和CE檢測均顯示有大片段等位基因丟失現(xiàn)象，二者的等位基因檢出率無統(tǒng)計學差異。Miseq檢測中有Penta E和D12S391兩個基因座共30個等位基因丟失，主要表現(xiàn)為Penta E等位基因丟失，占未檢出等位基因的93

17、.33%，其片段長度為362bp~467bp。CE檢測中有11個基因座共33個等位基因丟失，75.8%丟失等位基因的片段長度大于300bp。
　　24例降解樣本進行55個SNPs的SNaPshot復合分型和Miseq測序平臺進行SNP一致性研究，兩個試劑盒共有43個相同位點。比較兩種方法的結(jié)果顯示共有5個SNPs的分型不一致，其中2個SNPs的SNaPshot分型結(jié)果丟失一個等位基因，3個SNPs的Miseq檢測結(jié)果丟失一個等位基

18、因。兩種方法的等位基因檢出率無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：
　　1.腫瘤組織SNP的突變率明顯低于STR，SNP更適合于腫瘤組織的個體識別和親緣鑒定。
　　2.長期福爾馬林固定的組織易發(fā)生降解，SNP比STR在降解腫瘤組織檢驗中更具優(yōu)勢。
　　3.與SNPs SNaPshot分析方法相比，Miseq FGx測序平臺對于腫瘤樣本和降解檢材的檢測顯示出了更高的靈敏度，測序數(shù)據(jù)具有一定準確性和可靠性，可以作為腫瘤樣本檢測時