少汗型外胚層發(fā)育不良癥eda基因突變分析及其功能初探.pdf

1、目的：克隆少汗型外胚層發(fā)育不良癥eda-A1基因并進(jìn)行突變分析，同時(shí)構(gòu)建eda-A1基因編碼序列(CDS)突變型(M)和野生型(W)的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W，轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV)，觀察細(xì)胞周期的變化，以進(jìn)行eda基因功能研究。 方法：設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)的引物，從HED患者和正常對(duì)照者外周血淋巴細(xì)胞中提取總mRNA，利用RT-PCR法克隆eda-A1(M/W)基因cD

2、NA序列；運(yùn)用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pcDNA3.1(-)載體和eda-A1(M/W)基因片段，將eda-A1(M/W)插入到pcDNA3.1(-)載體中，從而構(gòu)建新的真核表達(dá)載體，命名為pcDNA3.1(-)-eda-A1-M和pcDNA3.1(-)-eda.A1-W，重組載體PCR、雙酶切、DNA測(cè)序分析；重組載體轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV)，進(jìn)行eda基因超表達(dá)，以分析eda基因?qū)?xì)胞功能的影響。 結(jié)果：克隆少汗型

3、外胚層發(fā)育不良癥eda-A1基因并發(fā)現(xiàn)未見報(bào)道過(guò)的907位A→C(A907C)錯(cuò)義突變，導(dǎo)致306位編碼氨基酸由谷氨酰胺變異為脯氨酸(Gln306→Pro)；經(jīng)PCR、雙酶切驗(yàn)證，成功構(gòu)建了pcDNA3.1(-)-eda-A1-W/M的真核表達(dá)載體；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：1)與空質(zhì)粒組(對(duì)照組，C)組相比，野生型(Wlid，W)組S細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞明顯減少(P<0.01)；突變體(Mutant，M)組中有更多細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期，