納米抗體N-28模擬DON抗原的分子機制研究及定點改造.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）主要是由禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌等鐮刀菌產生的次級代謝產物，廣泛存在于大麥、小麥、玉米等谷物及其制品中，嚴重危害人類及動物的健康。DON具有急性和慢性毒性，可引起厭食、嘔吐、腹瀉和發(fā)燒等癥狀，同時還具有細胞毒性、免疫毒性等多種毒性作用。鑒于DON的巨大危害，國內外研究人員已經建立起了多種檢測方法；其中，免疫分析法由于其簡便、快速、特異性好、適合高通量檢測等特點而被廣泛應用。

2、　　免疫學分析法基于抗原-抗體的特異性結合，為提高靈敏度，最直接的方法是制備高親和力的天然或人工抗體；但該方法較為困難，且容易遇到瓶頸。另一種方法為改造抗原；針對小分子檢測，改造抗原進行異源性分析往往能提高免疫分析方法的靈敏度。傳統(tǒng)的抗原改造是通過人工合成半抗原的結構類似物，但該方法具有一定的盲目性，過程較復雜，且人工合成過程會對操作人員和環(huán)境帶來危害。
　　本研究以DON單克隆抗體為靶分子，從駝源天然納米抗體庫中淘選與DON單抗

3、特異結合的納米抗體，以該納米抗體作為DON抗原模擬物，替代傳統(tǒng)的人工抗原，不僅減少了人工抗原合成過程中DON的污染，而且建立了DON的異源性免疫分析方法提高了檢測靈敏度。采用分子模擬技術和丙氨酸掃描技術，構建并驗證了納米抗體與DON抗體的結合模型，從分子水平上揭示了納米抗體模擬DON抗原的作用機制。繼而采用定點飽和突變技術，對納米抗體進行改造，獲得靈敏度提高的突變子，并以其建立免疫學檢測方法。主要研究結果如下：
　　1.基于納米抗

4、體的DON抗原模擬物的淘選
　　采用“1輪酸洗脫+3輪競爭洗脫”的組合洗脫方式，經過4輪淘選，獲得了兩個能與DON標品特異性競爭結合DON單抗的噬菌體克隆，分別命名為P-28和P-31。分別建立了基于P-28和P-31的Phage-ELISA標準曲線，IC50分別為78.89±1.77ng/mL和68.18±1.15ng/mL，線性范圍分別為21.24-316.52ng/mL和16.36-262.05ng/mL。
　　2.納

5、米抗體的表達及其在免疫檢測中的應用
　　將P-28和P-31的編碼基因克隆至pET-25b(+)表達載體，并轉入E.coli Rosetta(DE3)表達菌，經IPTG誘導表達并純化，獲得納米抗體蛋白N-28和N-31。以N-28和N-31分別建立了ELISA標準曲線，IC50分別為8.77±0.4 ng/mL和19.97±0.84ng/mL，靈敏度比基于DON-BSA建立的標準曲線（IC50為163.69±2.68ng/mL）分

6、別提高了18倍和8倍。以N-28作為檢測抗原建立了檢測谷物中DON的間接競爭ELISA，用該方法對谷物樣品進行檢測，同時與商業(yè)化ELISA試劑盒進行對比，結果顯示兩種方法的相關性系數R2=0.997。
　　3.納米抗體N-28模擬DON抗原分子機制的研究
　　采用分子模擬技術構建了N-28/DON與anti-DON ScFv的結合模型，比較兩個模型發(fā)現N-28與DON對接于ScFv的同一位點，N-28的CDR3區(qū)氨基酸Thr

7、102-Ser106能夠模擬DON與ScFv相互結合。隨后采用丙氨酸掃描技術驗證了分子模擬預測的對接模型。
　　4.納米抗體N-28的定點改造
　　將N-28的5個關鍵氨基酸分別進行定點飽和突變，通過Phage-ELISA和測序進行篩選和鑒定，最終得到77個不同的突變子；其中3個突變子（N-28-T102Y、N-28-V103L和N-28-Y105F）的靈敏度與野生型N-28相比分別提高了3.2、1.5和2.2倍。以N-28