頸動脈支架置入后血管炎性反應的動態(tài)變化及機制研究.pdf

1、目的：觀察頸動脈支架置入術(shù)后局部炎癥反應的炎癥因子及其動態(tài)變化，了解MMP-9及其他炎癥因子的變化規(guī)律及作用時間，為后期藥物干預實驗提供依據(jù)。觀察機械損傷的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清對THP-1細胞的激活作用，探討其作為動脈支架置入術(shù)后炎癥反應的離體模型的可行性。闡明細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2)-轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1(ETS-like-1，ELK-1)通路在機械

2、損傷的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清對THP-1細胞的激活并產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)過程中的作用，從而了解可能的炎癥反應作用機制和信號途徑。探索血管緊張素酶受體抑制劑(angiotensin receptor bloker，ARB)類藥物替米沙坦對該通路可能的影響，以評估該類藥物在預防頸動脈支架置入后血管再狹窄和卒中終點事件中的作用和應用前景。
　　方法：
　　第一部分：對行

3、頸動脈支架置入術(shù)的患者分別于術(shù)前、術(shù)后24小時、術(shù)后3個月、術(shù)后半年進行隨訪，采集基本情況、服藥情況、臨床事件、并發(fā)癥的發(fā)生，并采集外周血血清使用ELISA試劑盒檢測炎癥因子白細胞介素Iβ(interleukin-1β，IL-1β)，白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)，MMP-9的動態(tài)變化，以及采集外周血單核細胞使用流式細胞術(shù)檢測

4、細胞膜上Toll樣受體-4(Toll like receptor 4，TLR-4)表達情況。
　　第二部分：正常內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上清作為陰性對照組，檢測單核細胞系THP-1細胞在不同程度機械損傷的內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上清的作用下的對內(nèi)皮細胞的粘附能力。正常內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上清作為陰性對照，在機械損傷的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清的作用下，transwell體外模型檢測THP-1細胞的趨化能力和侵襲能力的變化，免疫熒光檢測在這一過程中的ERK1/2的活化

5、及活化部位。
　　第三部分：正常內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上清作為陰性對照組，western blot檢測單核細胞系THP-1細胞在機械損傷的內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上清的作用下的磷酸化的ERK1/2(phosphorylation extracellular regulated kinase1/2，P-ERK1/2)、磷酸化的ELK-1(phosphorylation ETS-like-1，P-ELK-1)及MMP-9的表達時間規(guī)律。通過PD9805

6、9(ERK1/2阻滯劑)對THP-1阻滯作用，觀察其對機械損傷的內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上清誘導THP-1細胞P-ERK1/2、P-ELK-1及MMP-9表達的影響。噻唑藍(3-4，5-Dimethylthiazol-2-y1-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法繪制藥物抑制曲線，篩選ARB類藥物替米沙坦作用于THP-1細胞的最佳濃度。使用替米沙坦孵育THP-1細胞1小時后，再更換為機械損傷的內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上

7、清的對其進行刺激，觀察P-ERK1/2、P-ELK-1及MMP-9的表達變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分：共有74名患者納入實驗，男性48人，女性26人，平均年齡為66.15±7.39歲，半年隨訪期內(nèi)患者中發(fā)生短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack，TIA)1例，死亡1例，卒中2例，出血傾向3例，未發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)再狹窄的患者。炎癥因子IL-1β，IL-6，TGF-β，MMP-9在支架置入術(shù)后24小時

8、均明顯上升(P<0.05)。其中IL-1β，IL-6，TGF-β在術(shù)后3個月回落至術(shù)前表達水平，但MMP-9在3個月時仍保持高表達(P<0.05)。TLR-4在術(shù)前術(shù)后表達變化不明顯(P>0.05)，隨訪顯示，在支架置入術(shù)后3個月，其表達變化亦不大(P>0.05)。
　　第二部分：機械損傷的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清能增強THP-1細胞的粘附能力，中度損傷組的作用能力最強(P<0.05)。與陰性對照組相比，THP-1細胞趨化能力及侵襲能力也

9、得到了增強(P<0.05)。其P-ERK1/2的表達從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，并在作用后15min時達到了最強。
　　第三部分：機械損傷的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清能誘導THP-1細胞產(chǎn)生P-ERK1/2、P-ELK-1及MMP-9，其中P-ERK1/2在誘導后15分鐘、P-ELK-1在誘導后15分鐘，MMP-9在誘導后6小時達到高峰(P<0.05)。ERK1/2阻滯劑可降低P-ELK-1及MMP-9表達(P<0.05)。替米沙坦的對THP-1細胞

10、作用的最佳濃度為10μ mol/L，其可通過降低ELK-1的磷酸化從而降低MMP-9的表達(P<0.05)，而對ERK1/2的活化影響不大(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.IL-1β，IL-6，TGF-β，MMP-9均在頸動脈支架置入術(shù)后的急性炎癥反應中發(fā)揮作用，術(shù)后慢性期血管重塑再狹窄可能與MMP-9的高表達有關(guān)。
　　2.TLR-4是否參與了支架置入術(shù)后的急性期的炎癥反應以及慢性期的重塑過程尚不明確，還需要進