BBG對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討細(xì)胞膜門控離子通道 P2X7與腦創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)的關(guān)系；應(yīng)用 P2X7受體抑制劑BBG進(jìn)行干預(yù)，檢測其對(duì)炎性因子IL-1β、TNF-α及PKCγ表達(dá)的影響，探討 BBG的抗炎作用和腦保護(hù)機(jī)制，為腦創(chuàng)傷后的炎性反應(yīng)作為治療靶點(diǎn)的研究開辟新的思路。
　　方法：應(yīng)用120只 SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組：①Sham組（n=40），②TBI組（n=40）③BBG組（n=40）。各組分為創(chuàng)傷后6h、12h、24h及48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察取

2、材。使用Marmarou法建立中度彌漫性TBI模型。對(duì)下列指標(biāo)進(jìn)行檢測：①使用 HE染色法觀察，腦組織海馬 CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)變化；②使用干濕比重法檢測各組的腦組織水腫程度；③激光共聚焦法檢測 PKCγ的表達(dá)定位情況；④Western-blot法檢測PKCγ、IL-1β、TNF-α和P2X7的蛋白表達(dá)量。⑤另取32只大鼠在創(chuàng)傷后7-11天行 Morris水迷宮測試，對(duì)其空間學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行檢測。應(yīng)用 Gel-Doc軟件分析系統(tǒng)對(duì)部分實(shí)驗(yàn)

3、結(jié)果進(jìn)行量化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件，使用重復(fù)的單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1 HE染色結(jié)果：Sham組海馬區(qū)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、數(shù)目較多、排列規(guī)則。TBI組織疏松，明顯水腫，微血管周圍間隙和細(xì)胞周圍間隙顯著增寬；海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞、排列不規(guī)律、數(shù)量顯著減少，胞漿嗜色性明顯減弱，核固縮，部分核仁消失。BBG組病理學(xué)改變?nèi)匀幻黠@，但是與

4、TBI組比較，水腫有所減輕，微血管及細(xì)胞周圍間隙的增寬程度減??；海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)較完整，胞核固縮較TBI組有所減輕。2大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能檢測結(jié)果：與 Sham組比較，TBI組大鼠平均逃避潛伏期顯著增長（P＜0.05）。與TBI組比較，BBG組在9、10天平均逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），但仍然長于 sham組。在創(chuàng)傷后11天的空間搜索實(shí)驗(yàn)過程中，與 Sham組相比，TBI組穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)所在象限路程比及時(shí)間比均顯著減少

5、（P＜0.05）；與TBI組相比，BBG治療組穿越平臺(tái)次數(shù)和2個(gè)比值均顯著增加（P＜0.05）。3腦水腫的測定：Sham組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織水含量未見差異。TBI組的腦組織水含量隨創(chuàng)傷后時(shí)間延長逐漸升高，在3h、6h、12h、24h均顯著高于sham組。BBG治療組3-24h的含水量顯著低于TBI組（P＜0.05），但仍略高于sham組。4 P2X7的Western blot檢測結(jié)果：sham組P2X7有很弱的基礎(chǔ)表達(dá)且各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)無

6、明顯差異。TBI組與 sham組對(duì)比，6h時(shí) P2X7表達(dá)開始升高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），24h開始回落，至48h逐漸減弱但仍高于 sham組（P＜0.05）。BBG組 P2X7表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)間變化趨勢(shì)與TBI組類似，但在創(chuàng)傷后6-48h的表達(dá)量仍然高于 sham組（P＜0.05）。5 PKCγ的Western blot檢測結(jié)果：Sham組：平均光密度分析發(fā)現(xiàn)僅有少量 PKCγ表達(dá)，其表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無差異。TB

7、I組：PKCγ蛋白量與Sham組比較，傷后6h增高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），持續(xù)高表達(dá)至創(chuàng)傷后24h（P＜0.05），創(chuàng)傷48h后 PKCγ蛋白表達(dá)有所下降，但仍顯著高于 Sham組（P＜0.05）。BBG組：PKCγ蛋白表達(dá)與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系和TBI組類似，但表達(dá)量顯著低于TBI組，其在傷后6-48h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6 IL-1β的Western blot檢測結(jié)果: Sham組僅有少量 IL

8、-1β表達(dá)，其表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無差異。TBI組與 Sham組比較，傷后6h增高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），持續(xù)高表達(dá)至創(chuàng)傷后24h（P＜0.05），創(chuàng)傷48h后IL-1β蛋白表達(dá)有所下降，但仍顯著高于Sham組（P＜0.05）。BBG組IL-1β蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)與TBI組類似，其表達(dá)量略低于TBI組，在傷后24h和48h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。7 PKCγ與NeuN的共聚焦檢測結(jié)果：FITC標(biāo)

9、記的綠色熒光顯示 PKCγ的表達(dá)，TRITC標(biāo)記的紅色熒光顯示神經(jīng)元標(biāo)記物 NeuN的表達(dá)。在 TBI后24h，NeuN（紅色）與PKCγ（綠色）在海馬區(qū)存在共定位。8 TNF-α western blot檢測結(jié)果：Sham組TNF-α蛋白表達(dá)量的比值在各時(shí)間點(diǎn)無變化。TBI組與 Sham組比，在傷后6h開始升高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），24-48h有所下降，但仍高于Sham組（P＜0.05）。BBG治療組TNF