LCN2和Ran在肝臟中作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒，會(huì)引起一系列肝臟疾病，如急性或慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前針對(duì)HBV感染相關(guān)疾病的診療計(jì)劃是根據(jù)血清和生化學(xué)指標(biāo)來(lái)制定的，如HBV DNA、 ALT、 AST、HBsAg、HBcAg等。然而，這些指標(biāo)受很多因素影響，如指標(biāo)本身的特異性、藥物治療等，因此，非常迫切需要能完全反應(yīng)乙型肝炎病情嚴(yán)重程度的分子標(biāo)志。據(jù)研究顯示，ConA誘導(dǎo)

2、的肝衰竭早期階段，LCN2、 Tim3、 MIP2和iNOS明顯升高，并且LCN2主要是由肝細(xì)胞分泌產(chǎn)生，IL-1β是誘導(dǎo)LCN2分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子。此外，自噬促進(jìn)IL-1β的分泌，Ran在自噬中的作用及機(jī)制不明。本研究的目的主要是探索這些指標(biāo)是否能反映HBV感染相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度，并深入闡明LCN2對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制以及Ran在自噬中的作用及機(jī)制。
　　第一部分:探索LCN2、Tim3、MIP2和 iNOS在判斷HBV感染

3、相關(guān)疾病嚴(yán)重程度的作用
　　研究方法:
　　總共收集6組患者血清樣本，分別為健康對(duì)照組、乙肝攜帶組、慢性乙型肝炎輕度組、慢性乙型肝炎中度組、慢性乙型肝炎重度組、肝衰竭組。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)LCN2、Tim3、MIP2和iNOS蛋白在各組之間的表達(dá)量的差異，并且分析了現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室所有指標(biāo)間的相關(guān)性。此外，對(duì)各組按ALT、 TBIL、DBIL正?；虍惓＿M(jìn)行細(xì)分后，評(píng)估LCN2、 Tim3、MIP2和iNOS對(duì)疾病程度的判斷。<

4、br>　　研究結(jié)果:
　　1.Tim3和MIP2表達(dá)量隨著慢性乙型肝炎輕中重度而增加，6組間的Tim3水平均有顯著差異。然而，MIP2在健康人與乙肝攜帶者或慢性乙型肝炎輕度患者卻無(wú)明顯的差異。與其他組相比，LCN2在慢性乙型肝炎重度患者中明顯升高，iNOS在肝衰竭組水平明顯升高。
　　2.上述4個(gè)指標(biāo)與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均有不同程度相關(guān)性，如Tim-3與MIP2、ALB、TBIL和DBIL的r值分別是0.498、-0.49、0

5、.487和0.535。并且，MIP2與TBIL(r=-0.484)和ALB(r=-0.564)負(fù)相關(guān)，與ALT(r=0.501)、 AST(r=0.597)，TBIL(r=0.584)、 DBIL(r=0.632)和IBIL(r=0.538)正相關(guān)。
　　3.在DBIL和TBIL升高、ALT正?；蛘弋惓r(shí)，Tim3和MIP2都可以很好的將肝衰竭與慢性乙型肝炎中重度患者區(qū)分開來(lái)。無(wú)論DBIL、 TBIL和ALT正?；蛘弋惓r(shí)，MIP

6、2均隨著慢性乙型肝炎輕中重度逐漸升高。當(dāng)ALT正常時(shí)，LCN2除不能區(qū)別慢乙肝輕中重度外，其余各組間均有顯著差異。
　　第二部分:闡明LCN2對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制
　　研究方法:
　　使用RNA干擾技術(shù)，用LCN2-siRNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，下調(diào)LCN2表達(dá)后觀察LCN2對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的影響。此外，通過(guò)基因芯片技術(shù)分析LCN2干擾組與陰性對(duì)照組間的差異性表達(dá)，并通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證，從而闡明LCN

7、2對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.IL-1β刺激Huh7細(xì)胞，導(dǎo)致LCN2、 IL-6和TNF-α在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均有明顯增加。
　　2.干擾Huh7細(xì)胞中LCN2的表達(dá)后，IL-6和TNF-α在mRNA和蛋白水平升高的更高
　　3.與陰性對(duì)照組相比，有180個(gè)基因上調(diào)，268個(gè)基因下調(diào)。差異表達(dá)的基因主要涉及13個(gè)生物學(xué)過(guò)程。
　　第三部分:Ran在自噬中的

8、作用及其機(jī)制
　　研究方法:
　　我們分別通過(guò)流式、cck8和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ran下調(diào)后對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲的影響。此外，使用WB或免疫熒光觀察Ran下調(diào)后自噬的改變以及對(duì)自噬相關(guān)基因sirt1、ATG5和ATG7的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.干擾Ran后腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)減少。
　　2.自噬發(fā)生時(shí)，Ran的定位由細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)向核外。
　　3.干擾Ran后自噬減弱，不影響凋亡。

9、r>　　4.Ran通過(guò)sirt1調(diào)節(jié)自噬，對(duì)自噬相關(guān)基因ATG5和ATG7無(wú)影響。
　　研究結(jié)論:
　　1.ALT,DBIL和Tim3在健康人、乙肝攜帶者、慢性乙型肝炎輕中重度和肝衰竭組均有顯著差異。ATL正常時(shí)，LCN2聯(lián)合MIP2可以有助于判斷HBV感染不同疾病狀態(tài)。
　　2.LCN2上調(diào)在IL-1β誘導(dǎo)的肝細(xì)胞刺激中發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用。基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)一步揭示LCN2通過(guò)調(diào)節(jié)壓力應(yīng)激、蛋白代謝、細(xì)胞周期和增殖發(fā)揮肝