Mfn-2基因在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：穩(wěn)定復(fù)制大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型,闡明在此模型下肝功能損傷與外周血 TNF-α及線粒體損傷之間的關(guān)系,并確定肝臟損傷最重時間點。分析缺血再灌注肝葉組織中PGC-1α、Mfn2基因表達變化及其可能調(diào)控機制,探討其與線粒體形態(tài)與功能改變之間的關(guān)系。并利用體外培養(yǎng)肝細胞研究 TNF-α對PGC-1α、Mfn2基因表達的調(diào)節(jié)作用及對線粒體形態(tài)與功能的影響。
　　方法：將 SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組(SH group)和缺血再灌注

2、組(I/R group),檢測不同灌注時間動脈血漿 TNF-α、ALT水平變化,觀察肝臟病理變化及線粒體形態(tài)與功能(線粒體 ATP、ROS生成及細胞凋亡)改變,實時定量 PCR及western blot方法檢測缺血再灌注肝組織中PGC-1α、Mfn2表達變化,分析 PGC-1α、Mfn2與線粒體損傷及肝臟缺血再灌注損傷之間的關(guān)系。再以 PGC-1α激動劑(羅格列酮)及抑制劑(GW9662)觀察其對缺血再灌注肝臟組織中PGC-1α、Mfn

3、2表達的影響,及對線粒體形態(tài)與功能和對肝功能的影響,探討其可能調(diào)控機制。最后以體外培養(yǎng)肝細胞株,分空白對照組、TNF-α處理組(400kU/L)、TNF-α(400kU/L)+羅格列酮(10μmol/L)處理組,觀察其對 PGC-1α、Mfn2表達的影響,及對線粒體形態(tài)與功能的影響。
　　結(jié)果：大鼠肝臟中葉和左葉缺血1h,再灌注0～8h,動脈血漿 TNF-α、ALT水平逐漸升高尤以再灌注6h升高最明顯(121.64±15.62vs

4、4.85±0.14 pg/ml,P<0.01;1001.18±101.27vs16.85±3.14IU/L,P<0.01),之后漸降低;再灌注肝組織呈不同程度變性,伴少量嗜酸性壞死及炎癥細胞侵潤,以再灌注6h最重;線粒體膜、基質(zhì)、嵴等形態(tài)學(xué)的改變以再灌注6h最重;線粒體 ATP生成漸降低,以再灌注6h最低(1.54±0.07vs5.65±0.24,P<0.01),而ROS生成以再灌注6h最高(200.34±10.27vs56.85±3.

5、14,P<0.01);再灌注6h PGC-1α、 Mfn2表達較假手術(shù)組明顯降低(4.0845±1.4018vs14.5337±3.1340;4.2519±1.1023vs15.4779±1.3530,P<0.01)。與I/R組比較,羅格列酮可明顯提高缺血再灌注肝組織中PGC-1α、Mfn2表達(9.9244±0.6882vs3.8637±1.0018;9.1840±0.9456vs4.3210±1.0011,P<0.01),肝功能及線

6、粒體形態(tài)與功能較 I/R組明顯改善,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在體外培養(yǎng)肝細胞中,與對照組比較,TNF-α可明顯抑制PGC-1α、Mfn2表達(1.2314±0.0366 vs2.5896±0.2591;0.7432±0.1626vs1.6236±0.3058,P<0.05),線粒體形態(tài)與功能改變與體內(nèi)試驗一致,而羅格列酮可通過提高 PGC-1α、Mfn2表達逆轉(zhuǎn)這一改變。結(jié)論大鼠肝臟缺血再灌注損傷與線粒體形態(tài)與功能改變密切相關(guān);PGC-1

7、α、Mfn2及其信號通路在缺血再灌注肝組織中被抑制,這種抑制與 TNF-α有關(guān),而且 Mfn2抑制導(dǎo)致線粒體形態(tài)與功能障礙,從而介導(dǎo)細胞及器官損傷。上調(diào)PGC-1α表達,可通過激活 Mfn2表達促進線粒體形態(tài)與功能的恢復(fù),從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。因此,通過 PGC-1α調(diào)控 Mfn2表達可能是介導(dǎo)肝臟缺血再灌注損傷的重要機制之一。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分:大鼠肝臟部分缺血再灌注損傷與線粒體損傷

8、之間的關(guān)系
　　目的：穩(wěn)定復(fù)制大鼠肝臟部分缺血再灌注損傷模型,闡明在此模型下肝功能損傷與外周血腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)及線粒體損傷之間的關(guān)系。
　　方法：將清潔級 Sprague Dawley雄性大鼠隨機分成兩組:缺血再灌注組(I/R group)、假手術(shù)組(SH group)。對于 I/R組,運用無創(chuàng)微動脈血管夾夾閉供應(yīng)肝臟左葉及中葉的門靜脈及肝動脈,持續(xù)1h后去除動脈夾,恢復(fù)血供進行再灌注,建立肝臟部分缺血

9、再灌注損傷動物模型;SH組則僅行開腹和肝門區(qū)解剖手術(shù),而不阻斷血流,余操作同 I/R組。分別于再灌注后0、2、4、6、8小時觀察大體及顯微肝臟病理變化;同時點采集外周動脈血檢測血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)水平;透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,同時檢測缺血再灌注肝組織中三磷酸腺苷(ATP)、氧化應(yīng)激活性氧(ROS)的變化,原位末端標記技術(shù)(TUNEL)法檢測細胞凋亡。
　　結(jié)果：肝臟中葉和

10、左葉在缺血1小時后,肝臟明顯蒼白,折光性下降,但仍有彈性,恢復(fù)灌注的瞬間,缺血肝臟組織立即呈暗紅色,且色澤均勻,再灌注不同時間后,肝臟缺血葉明顯表現(xiàn)為表面小葉灌注不良,呈小葉狀分布。在顯微鏡下觀察,缺血再灌注肝組織呈不同程度變性,伴少量嗜酸性壞死及炎癥細胞侵潤。I/R組 TN F-a lp ha水平較 S H組明顯升高,尤其在再灌注6小時變化明顯(121.64±15.62vs4.85±0.14 pg/ml,P<0.01)。肝功能損傷指標

11、(ALT水平)在 I/R組較 SH組明顯升高,尤以在恢復(fù)再灌注6小時明顯(1001.18±101.27vs16.85±3.14IU/L,P<0.01)。透射電鏡觀察線粒體可見 I/R組均有不同程度損傷,尤以再灌注6小時線粒體損傷最重,數(shù)量減少,腫脹明顯,嵴模糊不清,基質(zhì)密度降低,多數(shù)線粒體膜不完整,而SH組未見線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。I/R組線粒體 ATP生成較 SH組明顯降低,尤以再灌注6小時明顯(1.54±0.07vs5.65±0.24

12、,P<0.01)。I/R組線粒體 ROS生成較 SH組明顯升高,尤以再灌注6小時明顯(200.34±10.27 vs56.85±3.14,P<0.01)。I/R組肝細胞凋亡較 SH組均明顯增加,以再灌注6小時明顯(47.54±4.07％vs3.65±0.74％,P<0.01)。
　　結(jié)論：大鼠肝臟部分缺血再灌注過程中,動脈血清 TNF-α、ALT水平升高,均以恢復(fù)再灌注6小時為顯著;線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度損傷,尤以再灌注6小時

13、最重;線粒體 ATP的生成明顯降低,而ROS生成明顯增加,均以恢復(fù)再灌注6小時顯著;肝細胞凋亡指數(shù)隨著再灌注時間的延長逐漸增加,以再灌注6小時升高最明顯。肝臟缺血再灌注損傷與線粒體形態(tài)與功能改變密切相關(guān),而TNF-α可能是介導(dǎo)線粒體損傷的始動因子。
　　第二部分:PGC-1α和Mfn2基因在大鼠肝臟部分缺血再灌注后表達的變化及與損傷的關(guān)系
　　目的：觀察再灌注6h肝組織中PGC-1α和Mfn2基因 mRNA及蛋白表達變化,探

14、討 PGC-1α、Mfn2基因與大鼠肝臟缺血再灌注損傷及線粒體損傷之間的關(guān)系。
　　方法：將清潔級 Sprague Dawley雄性大鼠隨機分成二組:假手術(shù)組(SH group)和缺血再灌注組(I/R group),于再灌注6h取缺血再灌注肝臟標本;分別用實時定量 PCR方法及Western blot方法定量檢測再灌注肝組織中PGC-1α和Mfn2基因 mRNA及蛋白表達變化。
　　結(jié)果：I/R組大鼠缺血肝葉 PGC-1α、

15、Mfn2 mRNA的表達水平較 SH組明顯降低(4.0845±1.4018vs14.5337±3.1340;4.2519±1.1023vs15.4779±1.3530,P<0.01);I/R組大鼠缺血肝葉 PGC-1α、 Mfn2蛋白表達水平亦較 SH組明顯降低(27.35±5.83vs101.28±12.61;25.59±6.33vs110.12±13.62,P<0.01)。再灌注6h時,PGC-1α、Mfn2 mRNA及蛋白表達的變

16、化與肝功能損傷(ALT)及外周血TNF-alpha水平相關(guān)(P<0.01)。
　　結(jié)論：大鼠肝臟部分缺血再灌注過程中,缺血肝葉中PGC-1α、Mfn2 mRNA及蛋白表達明顯降低,這種變化與肝功能損傷及線粒體損傷相關(guān)。
　　第三部分:PGC-1α激動劑激活 Mfn2表達對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用
　　目的：觀察 PGC-1α激動劑羅格列酮和抑制劑 GW9662對再灌注6h肝臟組織中PGC-1α、Mfn2基因表達

17、的影響,及對肝臟功能和線粒體形態(tài)與功能的影響。
　　方法：將清潔級 Sprague Dawley雄性大鼠隨機分成四組:假手術(shù)組(SH group)、缺血再灌注組(I/R group)、羅格列酮組(Ros group)、GW9662組(GW9662 group)。羅格列酮組于術(shù)前30min靜脈注射羅格列酮(1mg/kg),GW9662組術(shù)前30min靜脈注射 GW9662(1mg/kg),其余兩組術(shù)前30min靜脈注射等量生理鹽水。

18、再灌注6h經(jīng)眼動脈取血行肝功能(ALT)檢測,取再灌注6h肝組織行 ATP、ROS水平測定,原位末端標記技術(shù)(TUNEL)法檢測細胞凋亡,透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,實時定量 PCR方法及Western blot方法檢測再灌注6h肝組織中PGC-1α和Mfn2基因 mRNA及蛋白表達變化。
　　結(jié)果：再灌注6hRos組 ALT水平較 I/R組明顯降低(385.54±56.96vs984.72±88.67IU/L,P<0.01)

19、,而GW9662組 ALT水平較 I/R組有進一步升高;Ros組線粒體形態(tài)較 I/R組明顯改善,線粒體膜完整,嵴清晰,基質(zhì)密度增加,片段化現(xiàn)象減輕,而GW9662組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)較 I/R組損傷進一步加重;Ros組再灌注肝組織中ATP含量較 I/R組明顯升高(4.31±0.18vs1.68±0.05μmol/mg,P<0.05),而GW9662組 ATP水平較 I/R組進一步降低;Ros組再灌注肝組織中ROS含量較I/R組明顯降低(84

20、.31±7.18vs198.74±13.05RLU,P<0.05),而GW9662組 ROS水平較 I/R組進一步升高; Ros組肝細胞凋亡指數(shù)較 I/R組明顯降低(29.31±7.18％vs45.74±5.05％,P<0.05),而GW9662組肝細胞凋亡指數(shù)較 I/R組進一步升高; Ros組肝組織中PGC-1α基因表達較 I/R組明顯提高(9.9244±0.6882vs3.8637±1.0018,P<0.05),Ros組 Mfn2基

21、因表達亦較 I/R組明顯提高(9.1840±0.9456vs4.3210±1.0011,P<0.05),而GW9662組 PGC-1α、Mfn2基因表達較 I/R組進一步降低。
　　結(jié)論：羅格列酮通過提高缺血再灌注肝組織中PGC-1α、Mfn2基因表達,促進線粒體融合,改善線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞,恢復(fù)線粒體功能,減少肝細胞凋亡,保護肝臟缺血再灌注損傷。
　　第四部分:TNF-α對肝細胞 PGC-1α和Mfn2基因表達的調(diào)控作用

22、以及對肝細胞線粒體形態(tài)及功能的影響
　　目的：觀察腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對肝細胞株 LO2細胞過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1α)、線粒體融合蛋白2(Mfn2)基因表達的調(diào)節(jié)作用以及對線粒體形態(tài)和功能的影響。
　　方法：分別以空白對照、TNF-α(400kU/L)、TNF-α(400kU/L)+羅格列酮(10μmol/L)作用LO2細胞株12h,實時定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western

23、 blot檢測各組細胞PGC-1α、Mfn2 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平,透射電鏡觀察線粒體形態(tài)變化,熒光素酶 ADP/ATP發(fā)光檢測細胞 ATP含量,熒光探針 DCFH-DA測定細胞 ROS生成水平,流式細胞儀測定細胞凋亡。
　　結(jié)果：經(jīng) TNF-α處理LO2細胞后 PGC-1α、Mfn2基因的mRNA及及蛋白表達水平顯著低于空白對照(1.2314±0.0366vs2.5896±0.2591; 0.7432±0.1626Vs1.

24、6236±0.3058,P<0.05)，而TNF-α+Ros組PGC-1α, Mfn2的mRN A及蛋白表達水平顯著高于TNF-α組(P<0.05); TNF-α組細胞線粒體數(shù)量減少，腫脹明顯，嵴模糊不清，基質(zhì)密度低，少數(shù)線粒體膜不完整，而TNF-α+Ros組線粒體形態(tài)明顯好轉(zhuǎn);TNF-α組細胞內(nèi)ATP濃度顯著低于空白對照組(2.08±0.15vs5.81±0.32,P<0.05)，而TNF-α+Ros組細胞內(nèi)ATP濃度顯著高于TNF

25、-α組(P<0.05); TNF-α組細胞內(nèi)ROS生成水平較空白對照組明顯升高(150.08±8.15vs55.81±6.32,P<0.05)，而TNF-α+Ros組細胞內(nèi)ROS生成水平顯著低于TNF-α組(P<0.05); TNF-α組細胞凋亡指數(shù)較空白對照組明顯增加(35.92±6.55％vs5.63±0.95％,P<0.05), TNF-α+Ros組細胞凋亡指數(shù)較TNF-α組明顯降低(P<0.05) 。
　　結(jié)論：TNF