芥菜籽在保護(hù)肝臟脂肪樣變中的作用機(jī)制.pdf

1、背景目的:
　　 非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝細(xì)胞脂肪聚集、肝小葉炎癥細(xì)胞浸潤、氣球樣變?yōu)樘卣鞯母闻K功能失調(diào)性病變。它包括單純性脂肪肝及由其演變的非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)和NASH相關(guān)性肝纖維化、肝硬化，甚至發(fā)展為肝細(xì)胞癌。NAFLD可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，原發(fā)性NAFLD主要與代謝綜合征(

2、metabolic syndrome，MS)有關(guān)，而繼發(fā)性NAFLD則由病毒性肝炎、藥物、空回腸短路等外科手術(shù)以及長(zhǎng)期靜脈內(nèi)營養(yǎng)等多種原因引起。近幾年來，脂肪肝的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已成為發(fā)達(dá)國家慢性肝病的首要原因。
　　 目前對(duì)于NAFLD發(fā)病機(jī)制占主流地位的是最早由Day和James[3]在1998年提出的“二次打擊學(xué)說”。初次打擊主要是指胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，形成單純性脂肪肝，二次打擊主要是指各種原因

3、所致的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷，引起非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。若NASH持續(xù)存在，便可進(jìn)一步發(fā)展為脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化，甚至是肝癌。
　　 脂肪肝是一種多病因引起的獲得性疾病，因此，積極尋找并去除可能的病因和誘因，防治原發(fā)病或相關(guān)危險(xiǎn)因素，積極成功的戒酒是防治脂肪肝最有效的措施，改變生活方式以及治療伴發(fā)病和相關(guān)危險(xiǎn)因素是整體治療的基本前提，合理膳食、中等量有氧運(yùn)動(dòng)、糾正不良生活方式是改善脂肪肝的有效方式。
　

4、　 芥菜籽為十字花科蕓苔屬植物的種子，近年來研究發(fā)現(xiàn)，芥菜籽中含有異硫氰酸酯、芥酸、酚類物質(zhì)、多糖等多種化學(xué)成分，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化等多種生理功能。異硫氰酸酯(ITCs)能誘導(dǎo)Ⅱ相水解酶的生成，從而抑制體內(nèi)氧化過程。我們?cè)谂c兩種已知的抗氧化劑（白梨露醇酐、云芝多糖）的比較試驗(yàn)中證實(shí):芥菜籽具有更有效的提高抗氧化酶(SOD)水平以及抑制巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)和脂質(zhì)過氧化的作用。
　　 本研究采用高脂飲食的非酒精性脂肪肝模型為

5、研究對(duì)象，應(yīng)用芥菜籽及其提取物，通過體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討在高血脂條件下，抗氧化劑保護(hù)肝臟損害，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，以及調(diào)節(jié)上述肝細(xì)胞脂肪代謝影響因子的表達(dá)與活性等方面，驗(yàn)證芥菜籽提取物在高血脂條件下的預(yù)防肝細(xì)胞脂肪樣變的功能，探討NAFLD的發(fā)病機(jī)制，并驗(yàn)證芥菜籽的預(yù)防作用。為芥菜籽應(yīng)用于非酒精性脂肪肝防治的可行性探討奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 1.體外實(shí)驗(yàn)部分:用Ox-LDL誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪樣變，實(shí)驗(yàn)分為

6、5組:(1)正常對(duì)照組(normal control group);(2)脂肪樣變模型組(ox-LDL);(3)ox-LDL+p38通路阻斷劑(ox-LDL+SB);(4)ox-LDL+ERK通路阻斷劑(ox-LDL+PD);(5) ox-LDL+JNK通路阻斷劑(ox-LDL+SP)。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:建立高脂誘發(fā)小鼠肝脂肪變性模型:選取60只ApoE-/-小鼠，隨機(jī)均分為5組，高脂食物喂養(yǎng)25周。分組如下:(1)正常對(duì)照

7、組(Normalcontrol);(2)高脂飲食組(HF only);(3)芥菜籽飲食組(7.5％MS only)(4)低劑量干預(yù)組(HF+5％MS);(5)高劑量干預(yù)組(HF+7.5％MS)。從實(shí)驗(yàn)第2周開始，高脂飲食組、低劑量干預(yù)組、高劑量干預(yù)組小鼠連續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常對(duì)照組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，芥菜籽飲食組給與7.5％MS的飲食，低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組在給與高脂飲食的同時(shí)分別給予含5％和7.5％芥菜籽的飼料喂養(yǎng)直至25周實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)束時(shí)。
　　 2.觀察各組小鼠的一般狀態(tài)，如攝食及飲水情況、營養(yǎng)狀況、體重、活動(dòng)狀態(tài)、毛色、光澤度變化等方面的改變情況。實(shí)驗(yàn)25周時(shí)處死小鼠，留取血漿、脾臟、肝臟。
　　 3.肝臟常規(guī)固定脫水，石蠟包埋切片，H.E染色觀察，確定肝臟病理組織學(xué)改變情況。
　　 4.流式細(xì)胞(FCM)術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾臟中CD4+、CD25+、CD8+、CD11c+細(xì)胞的比率。
　　 5.運(yùn)用多功能液相芯片分析系統(tǒng)(lum

9、inex200)檢測(cè)各組小鼠血漿中的IL-5、IL-12、IFN-γ的含量。
　　 6.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)小鼠血漿中脂聯(lián)素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)、TNF-α含量的變化，并檢測(cè)總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)含量的變化。
　　 7.流式細(xì)胞(FCM)術(shù)觀察Ox-LDL誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪樣變后

10、MAPK通路的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.實(shí)驗(yàn)終末期，高脂飲食組小鼠出現(xiàn)毛色偏黃，精神萎靡，各組活動(dòng)度好，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠均未出現(xiàn)腹瀉及大便異常。
　　 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察肝臟組織病理切片，結(jié)果顯示，給與芥菜籽干預(yù)組的小鼠較高脂飲食組小鼠的肝臟，細(xì)胞脂肪樣變程度減輕，且7.5％MS干預(yù)組比5％MS干預(yù)組小鼠作用更明顯，而給與單純7.5％MS飲食的小鼠肝臟，與對(duì)照組小鼠肝臟組織無明顯差別。
　　 3.7

11、.5％MS組、5％MS干預(yù)組、7.5％MS干預(yù)組和正常對(duì)照組小鼠脾臟中CD11 c+CD45RB+細(xì)胞的比率分別為1.89±0.91％、3.13±0.32％、2.03±0.23％、1.64±0.72％，HF組為4.22±0.36％，各實(shí)驗(yàn)組之間比較差異有顯著性(P=0.000)，其中7.5％MS干預(yù)組和正常對(duì)照組小鼠脾臟中CD11 c+CD45RB+細(xì)胞比率與HF組相比均降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 4.各組小鼠

12、脾臟中CD4CD25陽性細(xì)胞比率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異有顯著性(P=0.000)，其中7.5％MS干預(yù)組和7.5％MS組小鼠脾臟中CD4+CD25+細(xì)胞比率為46.93±5.99％、49.00±4.71％，與HF組（24.10±3.23％）相比升高，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 5.各組小鼠脾臟中CD4單陽性細(xì)胞與CD8單陽性細(xì)胞比值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異有顯著性(P=0.000)，其中正常對(duì)照組、7.5％MS組、5％MS干預(yù)組和7

13、.5％MS干預(yù)組小鼠脾臟中CD4+/CD8+值分別為1.98±0.79、1.92±0.93、1.88±0.81和1.96±0.69，與HF組的1.73±0.13相比升高，差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 6.各組小鼠血漿中IL-5的含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異有顯著性(P=0.000)，其中正常對(duì)照組和7.5％MS組小鼠血漿中IL-5的含量為266.88±56.98pg/ml、207.17±36.41pg/ml，與HF組的16.79

14、±7.25pg/ml相比增加，差異有顯著性(P＜0.01)，7.5％MS干預(yù)組小鼠血漿中IL-5含量為158.64±45.76，與HF組相比差異有顯著性(P＜0.01);各組小鼠血漿中IL-12和IFN-γ的含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異均有顯著性（P IL-12=0.001;PIFN-a=0.000），其中IL-12和IFN-γ的含量在7.5％MS干預(yù)組小鼠血漿中分別為385.65±67.42pg/ml和43.49±6.32 pg/ml，與HF

15、組的1555.14±255.90 pg/ml和178.87±16.50 pg/ml相比明顯減少，差異有顯著性(P＜0.01)。在7.5％MS組中IL-12和IFN-γ的含量分別為:339.50±64.53pg/ml、37.87±6.11 pg/ml，與HF組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 7.各組小鼠血漿中TG、LDL含量有組間差異(P=0.000;P=0.000)，與HF模型組相比含量顯著降低，其中7.5％MS干預(yù)

16、組、5％MS干預(yù)組、7.5％MS組血漿中LDL含量分別為:0.29±0.004、0.39±0.04、0.021±0.003，與HF模型組（0.077±0.008）相比，LDL含量顯著下降(P＜0.01)，7.5％MS組TG含量為0.11±0.02，與HF模型組（0.83±0.93）相比，差異有顯著性(P＜0.01);各組小鼠血漿HDL含量有差異(P=0.000)，7.5％MS組、5％MS干預(yù)組及7.5％MS干預(yù)組小鼠血漿中HDL含量分別

17、為:0.053±0.01、0.029±0.01、0.055±0.01，與HF模型組（0.024±0.01）相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而各組小鼠血漿中總膽固醇含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8.對(duì)脂肪因子的檢測(cè)顯示，各組小鼠血清中瘦素(Leptin)的含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異有顯著性(P=0.000)，其中7.5％MS組及對(duì)照組小鼠血清Leptin水平分別為0.035±0.006和0.020±0.008

18、，與HF模型組(0.075±0.07)相比，差異有顯著性(P＜0.01);各組小鼠血清抵抗素(Resisitin)含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，其中7.5％MS組、7.5％MS干預(yù)組和正常對(duì)照組含量分別為:0.045±0.006、0.054±0.007和0.041±0.004，與HF模型(0.106±0.172)相比，含量顯著下降(P＜0.05);各組小鼠血清脂聯(lián)素(Adiponectin)含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)，

19、其中7.5％MS組、7.5％MS干預(yù)組和正常對(duì)照組含量分別為:0.082±0.007、0.059±0.010和0.083±0.009，與HF模型組(0.236±0.06)相比，含量顯著增加(P＜0.05);各組小鼠血清中TNF-α含量有差異(p=0.000)，其中7.5％MS組、7.5％MS干預(yù)組和正常對(duì)照組含量分別為:0.022±0.008、0.035±0.008和0.024±0.006，與HF模型組(0.074±0.009)相比，含

20、量顯著下降(P＜0.05)。
　　 9.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ox-LDL誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪樣變可能與ERK-MAPK通路有關(guān)，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，加入ERK通路抑制劑后，脂肪樣變的細(xì)胞比例明顯減少，而加入p38和JNK的抑制劑則無此現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 1.芥菜籽對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝具有預(yù)防作用，能明顯降低肝細(xì)胞脂肪樣變的發(fā)生，隨著芥菜籽濃度的增加，其預(yù)防脂肪肝發(fā)生的作用明顯增強(qiáng)。

21、r>　　 2.芥菜籽預(yù)防小鼠脂肪肝作用機(jī)制與ERK-MAPK通路有關(guān)。
　　 3.在高脂飲食誘導(dǎo)脂肪肝形成過程中，芥菜籽能降低小鼠血漿中TG、LDL水平，升高HDL水平，但不改變總膽固醇含量;降低小鼠血漿中瘦素、抵抗素、TNF-α水平，增加脂聯(lián)素表達(dá)水平;提高實(shí)驗(yàn)小鼠機(jī)體CD4/CD8的比例，維持T細(xì)胞亞群間的平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高淋巴細(xì)胞活性;提高CD4+CD25+細(xì)胞水平，使其介導(dǎo)免疫耐受減輕炎癥反應(yīng);糾正高脂飲食引