基于TGF-β1-Smads和ERK通路cross-talk研究新風(fēng)膠囊改善AA大鼠肺功能的機(jī)理.pdf

1、目的：在中醫(yī)“肺脾相關(guān)”理論指導(dǎo)下，以“肺痹”為切入點(diǎn)，分析、總結(jié)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）肺功能損傷的中醫(yī)學(xué)病機(jī)，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度系統(tǒng)觀察佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)動(dòng)態(tài)變化和肺功能變化特點(diǎn)，檢測(cè)AA大鼠滑膜、肺組織TGF-β1/Smads、ERK信號(hào)通路及細(xì)胞因子變化，評(píng)價(jià)中藥新風(fēng)膠囊(XFC)對(duì)其影響，探討XFC改善AA大鼠肺功能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.理論研究系統(tǒng)搜集和整理RA肺病變

2、相關(guān)文獻(xiàn)，篩選和總結(jié)引起RA肺病變發(fā)病機(jī)制的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，評(píng)價(jià)和分析轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)Smads、ERK通路激活途徑，從理論角度研究RA肺功能降低與TGF-β1/Smads、ERK信號(hào)通路cross-talk的關(guān)系。依從中醫(yī)基礎(chǔ)理論闡述中醫(yī)“肺”與“脾”之間關(guān)系，從生理病理及病因病機(jī)角度探討“肺脾”的聯(lián)系，探尋健脾化濕通絡(luò)法治療RA肺功能降低的機(jī)制。
　　 2.實(shí)驗(yàn)研究將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(NC)組，模型對(duì)

3、照(MC)組，甲氨喋呤(MTX)組，雷公藤多苷片(TPT)組和XFC組，每組10只。除NC組外，其余大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(CFA)0.1ml致炎造模，第15d在尾根部注射CFA0.05 ml加強(qiáng)免疫，第19d給藥。各組的給藥量如下:XFC組0.034g/1ml/100g，TPT組0.57mg/1ml/100g，MTX組0.095mg/1ml/100g，NC、MC組予生理鹽水9mg/1ml/100g; XFC、TPT、NC、M

4、C組一天一次，MTX組一周一次，各組連續(xù)用藥30 d。觀察各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）和肺功能變化，光鏡、電鏡觀察滑膜、肺組織形態(tài)學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞因子TGF-β1、白介素(IL)-1β、IL-4、IL-10、γ干擾素（IFN-γ）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)表達(dá)，PCR、免疫組化、免疫印跡法檢測(cè)滑膜、肺組織Smads/ERK通路的變化。
　　 結(jié)果：
　　

5、1.理論研究結(jié)果
　　 1.1 TGF-β1/Smads通路的激活促使RA肺功能降低:TGF-β1首先與其受體TβRⅡ、TβRⅠ結(jié)合形成三聚體復(fù)合物，進(jìn)一步磷酸化Smad2/3，p-Smad2/3與TβRⅠ受體分離，即與Smad4結(jié)合形成復(fù)合體，攜帶信號(hào)從胞漿進(jìn)入胞核激活轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肺病變;而Smads7是抑制分子，Smad7抑制能力降低，不能抑制Smads信號(hào)的轉(zhuǎn)錄，失去對(duì)RA肺部病變的抑制作用，導(dǎo)致肺功能降低。
　　

6、1.2 ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)RA肺功能降低:ERK通路激活后可介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肺間質(zhì)和肺泡中過(guò)度積聚，使得肺泡距離增加形成間質(zhì)肺，肺毛細(xì)血管床和血流量的減少，血液流變學(xué)改變，出現(xiàn)肺彌散功能降低，氧和二氧化碳的交換作用減弱，同時(shí)ERK通路激活能調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因表達(dá)增加，導(dǎo)致肺功能降低。
　　 1.3 Smads和ERK通路cross-talk是RA肺功能下降的重要因素:TGF-β1

7、/Smad信號(hào)通路的激活過(guò)程也受ERK通路的調(diào)控，Smad2/3含有ERK磷酸化的位點(diǎn)，可被ERK磷酸化，促進(jìn)p-Smad2/3與Smad4的結(jié)合并轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，ERK通路受Smads通路調(diào)控，Smad4可調(diào)控ERK通路相關(guān)細(xì)胞因子或激酶的轉(zhuǎn)錄，從而激活ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，Smads和ERK通路cross-talk共同導(dǎo)致肺功能降低。
　　 1.4“脾虛”是RA肺功能降低的發(fā)病基礎(chǔ):脾虛致氣血虧虛，脾土不能生養(yǎng)肺金，日久導(dǎo)致肺氣失

8、養(yǎng)，肺宣肅功能失調(diào)，出現(xiàn)咳嗽、自汗、氣短等;脾虛運(yùn)化功能失常，水液停滯，濕停中焦，痰濕內(nèi)生，聚而生痰成飲，上干于肺，肺失治節(jié)，可見(jiàn)痰多，胸滿(mǎn)憋悶，喉中痰鳴有聲、胸背痛，遷延不愈，甚而喘促;脾虛致痰瘀互結(jié)，肺絡(luò)阻滯，多見(jiàn)肺紋理紊亂、結(jié)節(jié)、間質(zhì)纖維增生等。
　　 1.5“健脾化濕通絡(luò)法”能改善RA肺功能水平:根據(jù)RA肺功能降低的中醫(yī)病機(jī)呈現(xiàn)“脾胃虛弱、氣血不足、濕濁內(nèi)生、痰瘀互結(jié)”和“虛實(shí)夾雜”的特點(diǎn)，臨床上擬用“扶正祛邪”治則，采

9、用“健脾化濕通絡(luò)”治法，應(yīng)用XFC治療RA及肺功能損傷，取得了良好效果，XFC通過(guò)改善關(guān)節(jié)和全身癥狀體征，從而進(jìn)一步改善肺部癥狀體征，提高彌散功能和通氣功能。
　　 2.實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果
　　 2.1 AA大鼠肺功能變化及XFC對(duì)其影響與NC組比較，MC組大鼠肺功能FEV1、FEF50、FEF75、MMF、PEF降低(P＜0.01)。
　　 與MC組比較，XFC組FEV1、FEF50、FEF75、MMF、PEF升高（

10、P＜0.05或P＜0.01）。
　　 與MTX組比較，XFC組FEF50、FEF75、MMF升高(P＜0.05);與TPT組比較，XFC組肺功能參數(shù)FEF75、MMF升高（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 2.2 AA大鼠足趾腫脹度、AI、體質(zhì)量變化及XFC對(duì)其影響相關(guān)分析顯示:AA大鼠肺功能FEF75與足跖腫脹度呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EF50、FEF75與AI呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01或P＜0.05）。
　　 給藥前1d

11、，與NC組相比，MC組大鼠體質(zhì)量降低，足跖腫脹度、AI顯著升高(P＜0.01)。
　　 給藥后30 d，與NC組比較，MC組大鼠足趾腫脹度、AI升高;與MC組比較，各治療組大鼠足跖腫脹度、AI降低;與MTX組比較，XFC組足趾腫脹度差值降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　 2.3 AA大鼠關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)變化及XFC對(duì)其影響光鏡觀察:與NC組比較，MC組大鼠滑膜及其附屬組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管增多，滑膜分層增多，呈

12、絨毛狀突起嵌入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，關(guān)節(jié)軟骨表面剝脫或缺如。電鏡觀察:MC組滑膜細(xì)胞變形，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、破壞，核膜不完整，染色質(zhì)分布不均，嵴突排列不規(guī)整或部分消失;
　　 XFC治療后，大鼠滑膜可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分滑膜嵌入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，關(guān)節(jié)面較規(guī)整;滑膜細(xì)胞線粒體少量變形、腫脹，核膜邊界較清楚，染色質(zhì)較均勻，大部分嵴突排列完整。與MTX組比較，XFC組滑膜細(xì)胞線粒體腫脹減輕;XFC組TPT組比較無(wú)明顯差異。

13、　　 2.4 AA大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化及XFC對(duì)其影響光鏡觀察顯示:與NC組比較，MC組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)整，肺泡腔萎縮或消失，部分呈肺實(shí)質(zhì)性改變，肺間隔增寬，間質(zhì)中可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮細(xì)胞增生;電鏡觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量減少，胞膜結(jié)構(gòu)不完整，線粒體腫脹、變性，板層小體減少呈排空狀態(tài)，肺間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增生。
　　 XFC治療組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較規(guī)整，部分肺泡腔萎縮、變形，間質(zhì)中可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn);Ⅱ型肺泡上皮

14、細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，線粒體大部分完好，偶見(jiàn)板層小體排空現(xiàn)象;與MTX組比較，XFC組肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡上皮細(xì)胞減少;與TPT組比較無(wú)顯著差異。
　　 2.5 AA大鼠血清細(xì)胞因子的變化及XFC對(duì)其影響相關(guān)分析顯示:AA大鼠肺功能FEV1、FEF75與IL-1β、IL-4呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EF25、FEF50、FEF75、MMF與TGF-β1、CTGF、FGF呈負(fù)相關(guān);PEF與IL-10呈正相關(guān)，F(xiàn)EV1、FEF50

15、與Th1/Th2呈正相關(guān)，F(xiàn)EF50、FEF75與IFN-γ呈正相關(guān)（P＜0.01或P＜0.05）。
　　 與NC組比較，MC組血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、TGF-β1、CTGF升高，IFN-γ、IL-10、Th1/Th2細(xì)胞、FGF降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　 與MC組比較，XFC組IL-1β、IL-4、TGF-β1、CTGF降低，IFN-γ、IL-10、Th1/Th2、FGF表達(dá)升高（P＜0.01

16、或P＜0.05）。
　　 與MTX組比較，XFC組CTGF降低IFN-γ、IL-10、Th1/Th2表達(dá)量升高（P＜0.05）;與TPT組比較，XFC組TGF-β1降低（P＜0.05）。
　　 2.6 AA大鼠滑膜、肺組織Smads通路變化及XFC對(duì)其影響相關(guān)分析顯示:AA大鼠肺功能FEV1與TGF-β1 mRNA、蛋白呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EF25與Smad4蛋白呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EF50與TβRⅡ蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EF75與TGF

17、-β1、Smad3 mRNA、p-Smad2/3蛋白呈負(fù)相關(guān)，PEF與TGF-β1蛋白呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）;FEF50、MMF與Smad7 mRNA呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 與NC組比較，MC組大鼠滑膜、肺組織TGF-β1、Smad2/3/4 mRNA和TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4蛋白表達(dá)升高，Smad7mRNA、蛋白表達(dá)降低（P＜0.01或P＜0.05）。

18、　　 與MC組比較，XFC組大鼠滑膜、肺組織Smad2、Smad3、Smad4 mRNA和TGF-β1、TβRI、TβRⅡ、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)降低， Smad7mRNA、蛋白表達(dá)升高（P＜0.01或P＜0.05）。
　　 與MTX組比較，XFC組滑膜、肺組織TGF-β1、Smad3 mRNA和TGF-β1、Smad2/3蛋白表達(dá)降低，肺Smad4 mRNA、TβRⅠ蛋白降低，滑膜、肺組織Smad7 mR

19、NA升高(P＜0.05);與TPT組比較，XFC組滑膜Smad3 mRNA和TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4蛋白降低，Smad7蛋白升高（P＜0.05），肺組織p-Smad2/3降低，Smad7 mRNA升高（P＜0.05）。
　　 2.7 AA大鼠滑膜、肺組織ERK1/2變化及XFC對(duì)其影響相關(guān)分析顯示:AA大鼠肺功能FEV1與ERK2 mRNA呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EF25與p-ERK1/2蛋白呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EF75、MMF

20、分別與ERK1/2、p-ERK1/2蛋白呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。肺組織ERK1mRNA與Smad3 mRNA、TβRⅡ蛋白呈正相關(guān)，ERK2 mRNA與p-Smad2/3呈正相關(guān)，ERK1/2蛋白與Smad2mRNA、Smad4蛋白呈正相關(guān)，p-ERK1/2蛋白與Smad4 mRNA、p-Smad2/3蛋白呈正相關(guān)(P＜0.05);p-ERK1/2蛋白與Smad7蛋白呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。
　　 與NC組比較，MC組大鼠滑

21、膜組織ERK2 mRNA、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高，肺組織ERK1、ERK2 mRNA、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高（P＜0.01或P＜0.05）。
　　 與MC組比較，XFC組大鼠滑膜組織ERK2 mRNA、p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低，肺組織ERK1、ERK2 mRNA、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　 與MTX組比較，XFC組肺組織ERK1、ERK2 m

22、RNA表達(dá)降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.AA大鼠肺功能的變化
　　 1.1 AA大鼠肺功能損傷特點(diǎn):AA大鼠存在肺功能損傷，肺功能變化以參數(shù)FEV1、MMF、PEF、FEF50、FEF75降低為主，主要表現(xiàn)特征為通氣功能障礙，并伴有一定程度的小氣道功能損傷。
　　 1.2 Smads和ERK通路cross-talk導(dǎo)致肺功能降低:Smads和ERK通路在啟動(dòng)子TGF-β1誘導(dǎo)下，逐漸被磷

23、酸化激活，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核參與轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，導(dǎo)致AA肺部病變發(fā)生，出現(xiàn)肺功能降低。
　　 1.3 RA肺功能降低中醫(yī)病機(jī)呈“脾虛濕盛”特征:“脾虛”在RA肺功能損傷發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，脾氣虧虛，正氣不足，肺氣虛弱;脾氣虧虛，痰濕內(nèi)生，肺失治節(jié);脾氣虧虛，痰瘀互結(jié)，肺絡(luò)阻滯。
　　 2.“健脾化濕通絡(luò)”中藥XFC對(duì)AA大鼠的療效
　　 2.1 XFC能明顯抑制AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng):XFC能降低AA大鼠足趾腫脹度和AI

24、，減少炎細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)滑膜的浸潤(rùn)，減輕局部充血和腫脹，抑制血管翳的形成，改善關(guān)節(jié)功能。
　　 2.2 XFC能明顯改善AA大鼠肺功能水平:XFC通過(guò)提高肺功能參數(shù)FEV1、FEF50、FEF75、MMF、PEF表達(dá)，改善AA大鼠肺部通氣功能和小氣道功能，增強(qiáng)肺部氣體交換率，提高肺功能水平。
　　 2.3 XFC能明顯提高AA大鼠體質(zhì)量:XFC通過(guò)健脾益氣、化濕通絡(luò)的功效，能明顯提高AA大鼠食欲及飲水量，增加體質(zhì)量水平，改善全

25、身癥狀和機(jī)能活動(dòng)。
　　 2.4 XFC能明顯調(diào)節(jié)AA大鼠肺組織形態(tài)學(xué):XFC能減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，通過(guò)抑制炎性介質(zhì)對(duì)肺組織的刺激，降低AA大鼠肺間質(zhì)纖維化程度，維持Ⅱ型肺泡細(xì)胞細(xì)胞器的功能和形態(tài)。
　　 3. XFC改善AA大鼠肺功能的機(jī)制
　　 3.1 XFC可降低AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)提高肺功能:XFC通過(guò)抑制滑膜組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)，降低全身炎癥反應(yīng)，減少炎癥介質(zhì)滲出及對(duì)肺組織器官的刺激，抑制肺間質(zhì)病變的發(fā)生，

26、改善肺功能水平。
　　 3.2 XFC可減輕AA大鼠肺部炎癥反應(yīng)提高肺功能:XFC通過(guò)抗炎作用，減少炎性介質(zhì)對(duì)肺泡的直接刺激，促進(jìn)中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞的吸收或清除，降低肺組織炎癥反應(yīng)，改善肺功能水平。
　　 3.3 XFC可調(diào)節(jié)AA大鼠細(xì)胞因子平衡提高肺功能:XFC通過(guò)上調(diào)IL-10、IFN-γ、FGF表達(dá)，下調(diào)IL-1β、IL-4、TGF-β1、CTGF表達(dá)，抑制AA大鼠肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生，提高肺功能水平。
　　

27、 3.4 XFC可改善AA大鼠肺組織形態(tài)學(xué)提高肺功能:XFC通過(guò)減少炎性滲出物對(duì)肺組織損傷，保持肺組織病理形態(tài)學(xué)，維持肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加肺泡的通氣功能和彌散功能，改善肺功能。
　　 3.5 XFC可調(diào)節(jié)AA大鼠TGF-β1/Smads通路提高肺功能:XFC通過(guò)提高Smad7表達(dá)，抑制p-Smad2/3與Smad4的結(jié)合及阻止Smad2/3磷酸化，延緩AA大鼠肺纖維化的發(fā)生，改善肺功能。
　　 3.6 XFC可抑制